双抗体夹心ELISA定量检测内毒素的方法学研究

目的 建立检测细菌内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ， ＥＴ）的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。方法用自制的抗ＬＰＳ－ｍＡｂ Ｃ３Ａ２和Ｈ３Ｄ３，分别作为包被和酶标记ｍＡｂ，建立双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，并进行了实验条件的选择。然后用优化后的双抗夹心法对检测ＬＰＳ的敏感性、特异性、重复性和回收率进行鉴定试验，并与鲎试验定量仪器比浊法和鲎试验定性法进行比较。结果双抗体夹心法检测ＬＰＳ的敏感性为５０ ｎｇ／Ｌ，特异性与准确性均高于仪器比浊法和鲎试验定性法，回收率是８６．７％～９７．４％，ＣＶ值为０．６２％～４．８％。结论建立的双抗夹心法，检测ＬＰＳ的敏感性、准确性和特异性均较良好，为临床诊治内毒素血症提供了一种简便快速准确特异的实验工具。

基于独特型-抗独特型初步建立玉米赤霉烯酮无毒ELISA定量检测技术

目的:初步建立以玉米赤霉烯酮(ZEN)抗独特型单抗替代玉米赤霉烯酮标准品,检测ZEN残留的无毒ELISA定量检测技术。方法:以ZEN-BSA为包被原,ZEN单抗(1G4)为反应抗体,分别以不同浓度的ZEN毒素或ZEN抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)为竞争物,建立竞争抑制曲线。根据抑制率在20%~80%间,在相同抑制率条件下,ZEN与1D5间浓度对应关系,绘制替代标准曲线及对应的浓度转换方程。以ZEN类似毒素代替ZEN作为竞争抗原,检验方法的特异性;板内、板间试验检验方法的精密度。结果:初步建立了ZEN无毒ELISA定量检测技术,1D5与ZEN毒素之间的替代标准曲线方程为:y=1.2846x1.9310(y为ZEN毒素浓度ng/ml,x为抗独特型抗体浓度(μg/ml)。检出限(IC2 0)为1.041 ng/ml,检测范围为1.041~25.99 ng/ml。方法的批内平均变异系数为3.88%,批间平均变异系数为4.96%。方法特异性好,与ZEN类似毒素几乎无交叉反应。结论:利用ZEN单抗和ZEN抗独特型单抗初步建立了ZEN的无毒ELISA定量检测方法。

鼠IgG定量ELISA实验参比品的制备及其应用

目的 制备一组用于小鼠IgG定量ELISA检测的实验参比品。方法 将三株杂交瘤细胞制备的小鼠腹水等体积混合，以葡萄球菌A蛋白（SPA）亲和层析纯化IgG，凯氏定氮法测定IgG含量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳作纯度鉴定并据此校正其IgG浓度，以特定保存液将其稀释成既定浓度系列，根据其在ELISA中的反应特征，制备浓度（自然对数）-A450值标准曲线，并将其用于对一组杂交瘤细胞培养上清中鼠单克隆抗体的IgG定量测定。结果提纯的鼠IgG经鉴定纯度达97．1％，且反应特性良好，其IgG含量与ELISA检测信号间有高度的相关性（r=0．990）。不同浓度的稀释系列经8次反复冻融，检测信号无显著变化，变异系数（CV）为1．87％～6．47％。将标准曲线计算所得浓度对设定浓度做回收实验分析，回收率89．1％～108．3％。并用其测得一组杂交瘤细胞培养上清的鼠IgG含量为8．0～51．5mg／L。结论 鉴定结果显示制备物定量准确，浓度范围适中，稳定性好，对于早期杂交瘤细胞分泌能力以及抗体稳定性的评价、单抗制剂的鉴定具有一定的应用价值。

单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制

目的制备抗人神经生长因子（h NGF）单克隆抗体,并开发一种检测h NGF含量的ELISA试剂盒。方法以重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗h NGF的单克隆抗体,然后建立快速检测h NGF含量的ELISA检测试剂盒。结果获得1株可分泌抗h NGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。建立1种检测h NGF含量的ELISA试剂盒,该检测方法的回收率为85%-105%,灵敏度为0.63 ng/ml,变异系数〈10%,且特异性良好。结论成功制备了抗h NGF的单克隆抗体,并建立了一种可快速检测h NGF含量的ELISA试剂盒。

新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的初步建立

目的制备新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(单抗),并用于建立一种可定量检测NDV病毒含量的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法(NDV NP ELISA)。方法基于NDV病毒株F48E9获得NP基因,经原核表达方式制备出重组抗原rNP;免疫小鼠制备NDV NP特异性单抗;单抗经HRP标记和配对筛选,建立NDV NP ELISA,分析其特异性、灵敏度、精密度、准确度和检测线性,并分析本方法定量检测的NP含量与PFU病毒滴度的定量相关性。结果建立基于单抗3C10和4E7的NDV NP ELISA,其定量检测NDV rNP的最佳线性范围为0.015~0.250μg/ml(R2=0.9974),回收率在88.4%~106.01%,变异系数小于3.4%;该方法具有良好特异性;该方法定量检测NDV抗原含量与PFU病毒感染滴度有较好的相关性(R2=0.9209)。结论建立NDV NP ELISA,可准确定量检测NDV病毒中的NP抗原含量,为NDV病毒含量的测定提供一种可靠简便的分析方法。

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的:建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体(HuMabs)NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法:采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabs NM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果:间接ELISA法检测HuMabs NM57的灵敏度为5ng/mL,组内及组间精密度分别为2.6%～6.0%、8.5%～11.3%。结论:建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabs NM57的检测。

生物膜干涉技术、HPLC及ELISA在抗体定量检测中的比较分析

目的比较3种方法定量检测抗体样品的异同，为抗体药物研发和生产过程中不同类型的样品定量检测选择合适的方法提供依据。方法分别利用生物膜干涉技术、ProteinG—HPLC以及双抗体夹心ELISA法建立定量检测抗体样品的方法，比较其检测的准确度、精密度及其检测特点。结果3种方法检测同一抗体样品的含量基本一致，生物膜干涉技术检测值相对标准偏差最小（CV〈5％），HPLC次之（CV〈8％）．ELISA法的CV值为5％～15％。结论生物膜干涉技术检测快速，结果精确，通量高，无需样品前处理，适合于样品筛选以及发酵原液、中间品等检测；ProteinG-HPLC检测准确，线性范围宽，回收率高，认可度高，适合于样品含量的确证；ELISA法最低检测限值小，操作简单，仪器要求低，适合于微量样品的检测。

日本血吸虫单克隆anti-anti-id的建株及初步鉴定

目的 制备日本血吸虫抗独特型抗体 (anti- id,Ab2 ) NP30的单克隆抗独特型抗体 (anti-anti- id,Ab3)。方法 应用辣根过氧化物酶标记的 NP30 (HRP- NP30 )免疫 BAL B/ c小鼠的脾细胞与SP2 / 0融合 ,制备单克隆 anti- anti- id。结果 获得 1株稳定分泌抗 NP30的单克隆抗体的细胞株 ,定名为 NP48。NP48的 Ig同型为 Ig G2 b。NP48与 SWAP和 SEA EL ISA反应均阳性。免疫组织化学显示 NP48可定位于虫卵内毛蚴头腺及毛蚴膜。结论 NP48是 NP30的特异性 anti- anti- id,可用于

奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

采用饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析方法制备奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus(体质量为500～1 000 g)免疫球蛋白(IgM),以其为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,免疫3～4次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法对杂交瘤进行筛选。结果表明:阳性克隆经3次亚克隆后,共获得6株针对罗非鱼IgM的单克隆抗体(mAb),分别命名为1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3,所有单抗均为IgG类,各株杂交瘤的细胞上清ELISA效价为1∶800～1∶3 200;制备4B3和1G11的腹水单抗,ELISA效价分别为1∶102 400和1∶6 400。免疫印迹试验结果表明,mAb 4B3能在变性条件下识别罗非鱼IgM的重链,约在相对分子质量85 000左右。用ELISA检测4B3对罗非鱼IgM的敏感性,IgM灵敏度为10μg/L。利用所制备的单抗4B3建立了评价无乳链球菌Streptococcus agalactiae灭活疫苗免疫罗非鱼血清抗体水平的三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)方法,结果表明:腹腔注射和浸泡免疫无乳链球菌灭活疫苗14 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗无乳链球菌的抗体比对照组稍有增加;免疫21 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗体均有明显增加;免疫35 d后增加更为显著,达到最高峰,注射组效价达1∶2 560,浸泡组达1∶640;免疫56 d后抗体开始下降,直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。本研究表明,所制备的罗非鱼IgM mAb可用于评价罗非鱼疫苗免疫效果及抗体产生规律等,具有广阔的应用前景。

小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

目的制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Westernblot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3ng和62.5ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。

双酚A二环氧甘油醚的免疫检测方法研究

目的快速检测湖水中的双酚A二环氧甘油醚。方法试验设计一种新型双酚A二环氧甘油醚半抗原,并成功与载体蛋白偶联,经过小鼠免疫、细胞融合技术和三次亚克隆等方法,成功筛选出了可以稳定分泌BADGE单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果成功制备了高灵敏度高特异性的双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体,可以用于针对双酚A二环氧甘油醚的间接竞争酶联免疫吸附测定(ic-ELISA)。基于单克隆抗体,绘制了标准曲线,结果显示,单克隆抗体的IC50=1.15 ng/mL,检测线性范围IC20~IC80为0.16~8.15 ng/mL。通过加标回收实验,BADGE在湖水的添加回收率均在80%~120%之间。结论双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体在实际湖水样品检测中的运用具有可行性。

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗体MAIPA定量检测方法的建立

目的分别建立针对人类血小板抗原(HPA)-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的定量血小板(PLT)抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测(MAIPA)方法。方法采用MAIPA方法检测不同浓度的标准或参比HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗血清,优化实验条件,在检测范围内绘制线性曲线,并分别分析其敏感性、特异性、准确性和精密度。结果针对HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3种抗体的MAIPA定量检测方法得到了优化,检测范围分别为0~4 IU、0~20 AU、0~20 AU,准确性(回收率)分别为96.20%~103.10%、97.90%~103.10%、100.20%~106.10%。批内精密度[变异系数(CV)]分别为1.3%~3.6%、2.7%~5.2%和4.7%~5.3%,批间精密度(CV)分别为4.0%~5.6%、4.4%~5.9%和3.2%~6.3%,检测人源抗体抗A、抗B、抗I、抗P均无明显阳性,具有良好的特异性。结论建立的针对HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗体的MAIPA定量检测体系均具有较高的敏感度、特异度、准确度和精密度,对于临床相关疾病的诊断和PLT安全输注具有重要的应用价值。

金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金定量检测方法的建立及应用

采用金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）免疫Balb/c小鼠,制备相应的单克隆抗体（m Ab）,并以此为基础建立SEA胶体金检测方法,通过胶体金读数仪进行牛乳样品中SEA的定量分析。SEA胶体金试纸方法检测限为0.339μg/L,定量限为0.844μg/L,线性范围为1~16μg/L,相关系数R2=0.9933。采用配对t-检验分析,胶体金检测法与ELISA法无显著差异。

基于黄芩苷单克隆抗体的ELISA快速检测方法的建立

目的:建立黄芩苷快速灵敏的的免疫分析检测方法。方法:以制备出的黄芩苷特异性单克隆抗体为基础,选择单抗最佳工作浓度,建立黄芩苷间接竞争酶联免疫分析方法,并应用此方法检测精制清开灵注射液中的黄芩苷含量。结果:该方法线性范围为2.67～1029.00 ng.mL-1,组内和组间差异均不超过3.31%,平均回收率为100.9%,检测工作时间可控制在4 h内。采用该方法检测精制清开灵注射液中黄芩苷的含量,所得结果与HPLC一致。结论:建立了黄芩苷的ELISA方法,可为含黄芩苷的中药材及复方的质量控制分析提供更加快速灵敏的检测方法。

口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测ELISA方法的建立

目的:利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断ELISA检测方法,进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法:首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应,然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上,用标准3B蛋白做12个梯度做对照,同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白3B含量。结果:回归曲线呈典型的S形,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R=0.99,检测范围为5～1500ng/ml,半数抑制浓度(Ic50)为130ng/ml。结论:该方法能特异、敏感的检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分,并进行定量。

基于芍药苷单克隆抗体的ELISA快速检测方法建立

目的:建立芍药苷快速、灵敏的酶联免疫分析(ELISA)检测方法,并使用新方法检测中药材白芍中芍药苷的含量。方法:以制备出的芍药苷特异性单克隆抗体为基础,通过考察线性关系、精密度、回收率等方法学指标,建立芍药苷间接竞争酶联免疫分析(icELISA)方法,并应用此方法检测中药材白芍中的芍药苷含量。结果:该方法线性范围为3.9~250 ng·mL^(-1),板内和板间差异均不超过9.8%,平均回收率<110%,检测工作时间可控制在2 h内。采用该方法检测中药材白芍中芍药苷的含量,所得结果与HPLC一致。结论:建立的芍药苷icELISA方法,可为含芍药苷的微量生物样品检测、中药材及复方的质量控制分析提供更加快速灵敏的检测方法。

基于抗大豆苷单克隆抗体的Ic-ELISA方法的建立

目的：建立大豆苷的快速免疫分析检测方法。方法：该研究通过大豆苷单克隆抗体与葛根素、芦丁等共9种中药小分子的交叉反应证明该抗体具有特异性,并以制备出的大豆苷特异性单克隆抗体为基础,建立了大豆苷间接竞争酶联免疫分析方法（Ic-ELISA）,并用此方法检测大豆中大豆苷的含量。结果：抗体与葛根素的交叉反应率为115%,与芦丁、甘草酸、栀子苷等小分子无交叉反应。该方法线性范围为10~10 000 ng·m L^-1,孔内差和板间差均小于6.3%,平均回收率为105.4%%。采用该方法检测大豆中大豆苷的含量,所得结果与HPLC法的结果一致。结论：该研究建立了大豆苷的Ic-ELISA方法,可为含大豆苷的中药及复方的质量控制分析提供更加快速灵敏的检测方法。

人IL-35单克隆抗体制备及其在定量ELISA检测方法中的应用

为了建立人白细胞介素-35 (IL-35)的定量ELISA检测方法,RT-PCR克隆了人IL-35的IL-27EBI3亚基和IL-12p35亚基的编码基因,在大肠杆菌中实现了2个亚基的高效表达。以大肠杆菌表达的IL-27EBI3和IL-12p35重组蛋白作为免疫原,免疫BaLb/c小鼠,选取阳性血清小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,用间接ELISA和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选和克隆,获得了稳定分泌抗IL-27EBI3和抗IL-12p35单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在效价测定和特异性鉴定的基础上,进一步筛选出一株能稳定分泌抗IL-27EBI3单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B11和一株能稳定分泌抗IL-12p35单克隆抗体杂交瘤细胞株3A10,亚类鉴定两株单抗均为IgG1。应用单抗3B11和3A10建立了IL-35双抗夹心定量ELISA检测方法,借助生物素-亲和素放大效应,该方法检测IL-35线性范围为3.12–200pg/mL,最低检测限为1.26pg/mL,与多种其他抗原的交叉反应率为0.1%,批内相对标准偏差(RSD)为5.1%–5.6%,批间RSD为5.6%–7.2%,添加回收率为89%–103%,达到定量分析的要求,为进一步组装IL-35定量ELISA检测试剂盒打下了基础。

森林脑炎病毒单克隆抗体的研制及抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用

目的制备森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)单克隆抗体,并建立TBEV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,初步应用于疫苗生产过程中TBEV抗原含量监测。方法以TBEV"森张"株灭活纯化全病毒作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备小鼠单抗杂交瘤及腹水抗体,纯化后鉴定单抗的特异性及相对亲和力。经单抗叠加ELISA配对,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以TBEV抗原标准品作为定量标准,建立剂量-反应曲线,验证该方法的敏感度、线性、特异性、准确性、试验内与试验间精密性,对5批TBEV灭活疫苗原液进行检测,初步验证方法的适用性。结果制备了4株抗TBEV杂交瘤细胞株:5F5、2G12、5E1及2H9;间接ELISA法测定腹水抗体效价为1︰106~1︰10~7,Western blot鉴定4株单抗均与TBEV包膜E蛋白发生特异性反应;4株单抗相对亲和力:2G12> 5F5> 2H9> 5E1;抗体配对筛选后,将5F5作为包被抗体,工作浓度为10μg/mL;2G12作为标记抗体,稀释倍数为1︰3 200倍。该方法对TBEV抗原最低检出限为0.009 8μg/mL;线性范围为0.078 1~2.5μg/mL,R~2> 0.98;检测TBEV疫苗生产相关原辅料成分无交叉反应;准确性验证病毒抗原回收率在96.2%~109.2%之间;试验内和试验间精密性变异系数分别在7.37%~8.40%、8.66%~9.38%之间;用该方法检测5批TBEV灭活疫苗原液呈剂量依赖关系。结论成功制备了TBEV小鼠单克隆抗体,并建立了TBEV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,该方法检测TBEV抗原准确可靠,为TBEV灭活疫苗研发及生产过程中病毒抗原检测提供了一种简便有效的监测方法。

ELISA法测定食蟹猴血清中抗PD-1单克隆抗体浓度

目的:建立灵敏度高、特异性好且快速的ELISA方法,用以测定食蟹猴血清中的抗PD-1单克隆抗体(代号BGB-A317)浓度。方法:建立间接ELISA方法对BGB-A317进行定量分析。测定原理:包被重组人PD-1,加入稀释的血清样品,之后加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(酶标抗体),再加入TMB底物进行显色和2 mol·L^(-1)硫酸作为终止液,在酶标仪上用双波长读取D_(450/630 nm)值,以标准曲线样品D_(450/630 nm)为纵坐标,以样品浓度为横坐标,进行非线性五参回归运算,得到标准曲线方程,将待测样品D_(450/630 nm)代入方程即可得到待测样品浓度。结果:建立并验证了该ELISA方法,定量范围为3~180 ng·mL^(-1)。精密度(板内和板间)均在±15%之内,准确度介于75%~125%;食蟹猴空白血清、样品稀释液和干扰单克隆抗体对BGB-A317在食蟹猴血清中的浓度测定无影响;稀释线性样品的精密度小于20%,准确度介于80%~120%;平行性样品的精密度为小于20%;BGB-A317在食蟹猴血清中室温放置4 h、-70℃以下放置70 d及反复冻融3次后均保持稳定,样品准确度均介于80%~120%。结论:方法学验证表明该间接ELISA方法具有良好的灵敏度、准确度、特异性和可重复性,可用于定量分析食蟹猴血清中BGB-A317的浓度。