牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性。SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,r LI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的r LI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法。各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的r LI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度为1∶10000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min。利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况。结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在。本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI血清流行病学调查提供技术支持。

PCV4 Cap抗体ELISA检测方法的建立及血清流行病学调查

旨在建立一种猪圆环病毒4(porcine circovirus type 4, PCV4)Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法,对猪群中PCV4抗体进行检测,并与以往的关于PCV4血清流行病学的调查结果进行对比研究,从而更全面地了解PCV4在猪群中的感染和流行情况。本研究利用原核表达系统成功表达PCV4 Cap蛋白,对反应条件进行优化,建立了基于PCV4 Cap蛋白的间接ELISA方法。采用建立的ELISA方法对中国18个省份的不同阶段的2 298份猪血清样本进行检测,以调查中国猪群中PCV4的血清学流行情况。同时将Cap-ELISA检测方法与之前建立的Rep-ELISA进行对比,平行检测845份血清样本。结果显示,在18个省份中,17个省的血清样本中检测到PCV4抗体。PCV4总血清阳性率为34.94%,母猪和育肥猪阳性率分别为59.95%和31.64%,仔猪阳性率为21.14%,保育猪中检出的阳性率最低,为4.20%。两种方法共同检测845份血清样本,符合率为82.84%,其中Cap-ELISA检测总阳性率为31.83%,Rep-ELISA检测总阳性率为35.03%。研究表明,PCV4在中国广泛传播,不同年龄阶段的猪只均能感染。Cap-ELISA和Rep-ELISA两种方法一致性高,从抗体消长规律来分析,两种方法都说明猪群感染PCV4主要在育肥猪和母猪阶段。本研究提供了中国PCV4的最新血清流行病学特征和PCV4在不同阶段猪群中的感染情况,进一步证实了PCV4在我国猪群中有一定的感染率,其危害值得进一步研究和关注。

牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

标本溶血对血站血液筛查实验室ELISA检测结果的影响

目的 分析标本溶血对血站实验室ELISA检测结果的影响,确定针对实验室试验项目及检测系统特异的可接受的溶血程度,为制定溶血标本接受标准提供依据。方法 针对HBsAg、HIV Ag/Ab、抗-HCV、抗-TP 4项ELISA试验,分别制备不同溶血梯度的阴性标本和弱阳性标本(S/CO≈2),使用几种常用的国产试剂对上述标本进行检测,分析不同程度溶血对各项目阴性和弱阳性标本检测结果的影响。结果 1)标本溶血对HBsAg、抗-HCV、抗-TP ELISA试验阴性和弱阳性标本的检测结果(反应性/非反应性)无影响;2)标本溶血对HIV Ag/Ab ELISA试验阴性和弱阳性标本的检测结果(反应性/非反应性)存在影响,建议将Hb 2 g/L作为HIV Ag/Ab ELISA试验可接受的溶血程度。结论 本研究确定了适用于本实验室相应试验项目和检测系统的溶血标本接受标准。溶血对血站实验室ELISA检测结果的影响与试剂、设备、环境等多种因素有关,实验室应结合自身具体情况进行评估和验证,科学合理地确定溶血标本接受标准。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用

为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。

不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公司ELISA试剂盒的灵敏度,还进一步评估了胎粪样品直接ELISA检测与血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测2种评估方法的灵敏度,为科学选择灵敏特异的ALV检测方法提供了良好评价模型。

基于N和G蛋白的HeV抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立亨德拉病毒(HeV)抗体的间接ELISA检测方法,人工合成HeV的N和G基因,并将其分别连接到原核表达载体PET-30a,经IPTG诱导、变复性处理及纯化后获得表达蛋白,免疫健康马获得阳性血清,用矩阵法对蛋白包被浓度和一抗稀释倍数进行确定,优化包被时间、封闭剂以及孵育时间等技术参数,并对建立方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性进行评估。经SDS-PAGE和Western blot验证,N和G两个蛋白均实现高效表达,间接ELISA方法中二者的最佳包被浓度分别为10μg/mL和8μg/mL,一抗血清的稀释倍数为1∶800,优化后的最佳反应条件为:N蛋白4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,一抗孵育时间30 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用60 min;G蛋白4℃包被过夜,2%BSA 37℃封闭2 h,一抗孵育时间80 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用80 min。结果表明,所建方法N蛋白的灵敏性大于1∶12800,G蛋白大于1∶6400,二者的临界值分别为0.235和0.267,特异性良好,批内、批间变异系数均小于10%,重复性良好,二者ROC曲线下面积分别为0.91和0.93,准确性高。试验结果可为海关、口岸以及出入境检验检疫等部门HeV临床血清学诊断提供技术支撑。

猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号:CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。

禽腺病毒4型Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白的单克隆抗体并建立Fiber-2蛋白的定量检测方法。本研究将原核表达的Fiber-2蛋白免疫BALB/c雌鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过免疫印迹、间接免疫荧光和抗体相加试验筛选杂交瘤细胞株;以制备的单克隆抗体为捕获抗体和酶标检测抗体,通过优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,建立特异性检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法。结果:本研究成功筛选到3株能够稳定传代的杂交瘤细胞株1H2、2A9和3E1,其分泌的抗体均与FAdV-4全病毒具有良好的反应性,可识别不同抗原表位;进一步发现,以1H2为捕获抗体、2A9为酶标检测抗体,能够建立检测Fiber-2蛋白的ELISA方法;该方法具有良好的重复性,批内重复及批间重复试验变异系数均小于10%;敏感性高,Fiber-2蛋白检测限为0.078 ng/μL;特异性好,不与FAdV-4的其他结构蛋白及鸭腺病毒3型的Fiber-2蛋白发生反应。综上,本研究成功制备了3株Fiber-2蛋白单克隆抗体,并建立了定量检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法,为后续FAdV-4基础研究和Fiber-2亚单位疫苗研究奠定了物质基础。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究

旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体(Anaplasma marginale)的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列(登录号:EU526889),构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。

抗大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体的制备及其间接ELISA检测方法的建立

大口黑鲈(Micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus,LMBV)是我国大口黑鲈养殖中的常发病原,主要引起大口黑鲈病毒性溃疡病,制约其养殖业的健康发展。为探究卵黄抗体在防控LMBV中的潜在作用,利用LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡,制备了抗LMBV卵黄抗体;通过筛选捕获物浓度、包被条件和封闭条件,建立了抗LMBV卵黄抗体的间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法;使用构建的方法,评估了LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后卵黄抗体的效价消减规律。结果表明,1‰(φ)β-丙内酯4℃作用72 h可完全灭活LMBV。间接ELISA反应中,每孔包被105 TCID50灭活病毒,37℃孵育2 h后,使用5%(φ)牛血清白蛋白37℃封闭2 h,可有效降低阴性对照组卵黄抗体的背景值;此外,所建立的检测方法与杂交醴弹状病毒卵黄抗体、未免疫的蛋黄提取物和空白细胞不存在交叉反应,特异性较高。LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡约48 d可产生特异性卵黄抗体,免疫后58 d效价升高至峰值(1∶12800),峰值水平可持续至免疫后128 d。所构建的LMBV卵黄抗体检测方法,可实时监测LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后的特异性卵黄抗体效价水平的变化规律,确定LMBV卵黄抗体的高效免疫程序及高免蛋收集持续期,为LMBV卵黄抗体产品的开发、应用及LMBV的防治提供了新思路。