猪瘟病毒RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测试验应用研究

本试验根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的PCR引物。以120份疑似猪瘟病料为试验材料,使用RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测2种方法,分别用这2种方法检测疑似病料,并且比较这2种方法在猪瘟病料检测中的实际差别。通过猪瘟病毒RT-PCR核酸检测结果及ELISA抗原检测结果相互印证,为云南猪瘟的诊断及防制提供了技术支持。

ELISA抗原标准化初步研究-硫酸铵沉淀虫卵抗原(AE)的提取与试用

本文报告了1％虫卵混悬液经不同饱和度的硫酸铵分段沉淀为4种抗原。筛选AE抗原与SEA作ELISA对其他寄生虫病人血清的交叉反应性进行对比观察。结果表明,AE对肺吸虫、姜片虫病人血清各有1例交叉反应;而SEA则各有4例。在任何抗原稀释度,检测参考血清时,AE的免疫比值均都高于SEA,有非常显著的差异,且制备简便易行,具有较好的应用价值。

ELISA抗原标准化初步研究—硫酸铵沉淀血吸虫卵抗原的化学与免疫学特性

本文初步分析了硫酸铵沉淀血吸虫卵抗原(AE)的一些化学及免疫学特性.结果表明,AE抗原含糖量较高,对热处理稳定,SDS—PAGE分析,分子量分布范围在12～76KD,其中14.5、26.55KD区带着色较深,免疫活性强于SEA,以pH9.6的碳酸盐缓冲液作为抗原稀释液包被反应板,检测效果最佳,包被抗原的反应板在4℃条件下至少能放置半年,适合于现场应用。

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒(CSFV)主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6。间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应。将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板(捕捉抗体),与兔抗CSFV IgG(检测抗体)联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值。最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%。

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%(121/121),检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显提高灵敏度,达到93.3%(14/15)。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。

双抗原夹心ELISA检测抗HCV总抗体

目的建立检测抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA法,评价其可行性。方法将与His或GST融合表达的HCV基因工程抗原,分别用作ELISA的包被和酶标记抗原,建立用于抗HCV总抗体检测的双抗原夹心ELISA。用此方法检测1 968份临床血清标本,并以间接ELISA(北京万泰试剂)与之对照;此外,用套式RT-PCR检测部分血清的HCV RNA。结果有1 761份血清2种ELISA检测均为阴性,有190份血清均为阳性,两种方法符合率为99.1%;有17份血清的检测结果不相符,间接法阳性而本法阴性的14份,其中HCV RT-PCR阳性1份;本法阳性而间接ELISA阴性的3份,其中RT-PCR阳性2份。双抗原夹心ELISA与间接ELISA的敏感性分别为99.48%、98.96%,特异性分别为99.94%、99.27%。结论新研制的检测抗HCV总抗体的双抗原夹心ELISA具有较高的敏感性和特异性,值得作进一步的深入研究。

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

本研究用纯化的Asial型口蹄疫病毒（Footandmouthdiseasevirus，FMDV）免疫BALB／c小鼠，按常规单克隆抗体技术方法，经筛选获得6株能稳定分泌抗Asial型FMDV单抗的杂交瘤细胞株。以牛抗口蹄疫病毒IgG为捕获抗体，选择一株单抗（184）用辣根过氧化物酶标记（HRP-184）作为检测抗体，建立了检测Asial型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出0．5859μg纯化Asial型FMDV抗原和2．5×10^3TCID50病毒，对O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测，均为阴性，无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法，具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可用于Asia1型FMDV的特异性检测。

抗原捕获ELISA对猪瘟的诊断效果

应用抗原捕获ELISA方法分别对现行猪瘟疫苗毒及接种疫苗后产生定型热的兔脾、不同地区可疑猪瘟组织样品进行检测。结果表明 ,ELISA方法对猪瘟强毒组织样品的检测效果良好 ,但对弱毒的检测并不敏感 。

兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

用兔出血症病毒(RHDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立RHDV抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为1mg/L,兔多抗血清最佳质量浓度为4mg/L。本方法可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26μg/L。对已知阳性样品的检测显示,捕获ELISA检测的病毒滴度是HA试验的3～13倍。对67份可疑病料,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,HA试验阳性检出率为55.2%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。本方法敏感性、特异性、稳定性良好,可应用于RHDV的快速、批量、特异检测。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）单克隆抗体包被酶标板，以兔多克隆抗体作为夹心抗体，建立BVDV抗原捕获ELISA（AC-ELISA）检测方法，优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明，单抗最佳包被质量浓度为5μg／mL，兔多抗血清最佳质量浓度为10μg／mL；单抗在4℃包被12～24h，多抗在37℃作用1h为双抗体的最佳反应条件；酶标抗体最适稀释度1：10000，最适作用时间为1h；采用1％BSA和1％明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC—ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品，同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比，3种方法符合率很高。研究表明AC—ELISA方法稳定性好，可用于BVDV的临床快速检测。

草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

研究以纯化的羊抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体作为捕获抗体,抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体为检测抗体,建立草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法,其最佳反应条件是:羊多克隆抗体包埋浓度为2.5μg/m L,抗草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体工作浓度为1:400稀释,以3%牛血清白蛋白作为封闭液。该方法的检测限为5×105 pfu/m L,且能够特异性检出发病草鱼内脏组织中的草鱼呼肠孤病毒。特异性试验结果表明该方法具有较高的特异性,与病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤春血症病毒等水产动物病毒株均不反应。该方法还具有较好的稳定性。

ELISA检测椰酵假单胞菌菌体抗原的研究

椰毒假单胞菌酵米面亚种,已知有0—Ⅲ、0—Ⅳ和0—Ⅴ等菌体抗原型。常规血清试管凝集法检测分型耗时费力。本文在制备不同血清型菌体抗原的抗体和辣根过氧化物酶抗体结合物的基础上,建立了检测椰酵假单胞菌的间接非竞争法、直接非竞争法和双抗体夹心ELISA法,具有快速、简便和较好的特异性。

双抗原夹心ELISA法检测抗念珠菌烯醇化酶抗体

目的建立检测抗念珠菌烯醇化酶(Eno)特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并进行临床应用评价。方法用基因工程制备的重组Eno作为包被抗原和酶标抗原,通过棋盘滴定法对双抗原夹心ELISA法的反应条件进行优化,对方法的敏感性、特异性和精密度进行考察。用双抗原夹心ELISA法测定291例住院患者(侵袭性念珠菌病114例,念珠菌定植82例,细菌感染患者95例)以及200名健康人血清,并与本实验室前期自建的间接ELISA法检测抗Eno抗体的结果进行比较。结果双抗原夹心ELISA法工作条件为:Eno抗原包被浓度为0.5μg/m L,酶标抗原1∶4 000稀释;封闭液为含50 g/L脱脂奶粉的PBS-T,待测血清稀释度为1∶100。患者血清检测结果显示,批内变异系数(CV)分别为6.8%、7.4%和5.9%;不同批次重复测定15次,其批间CV分别为10.1%、9.6%和12.4%。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为92.2%。通过ROC曲线确定cut off值吸光度(A)为0.209。检测侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)的敏感性和特异性分别为81.6%(93/114)和94.4%(356/377),敏感性高于检测抗Eno抗体的间接ELISA法(81.6%vs 76.1%)。结论建立了双抗原夹心ELISA法检测抗念珠菌Eno特异性抗体,可提高IC的诊断率,具有临床应用价值。

牛轮状病毒抗原捕获ELISA方法的建立与应用

为建立牛轮状病毒(BRV)抗原检测方法,本研究以BRV VP6蛋白的多克隆抗体为捕获抗体、VP7蛋白的G6/G10共享型单克隆抗体(MAb)为检测抗体,建立了BRV抗原捕获ELISA方法。特异性试验结果显示,该ELISA方法与牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒以及阿卡斑病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,本研究建立的ELISA方法最低可以检出10^(4.2) TCID_(50)病毒,而商品化ELISA试剂盒和RT-PCR方法的最低检出限分别为10^(4.86) TCID_(50)和10^(3.36) TCID_(50)病毒。该方法组内和组间的变异系数均小于10%,表明重复性良好。应用该ELISA方法对67份牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BRV阳性率为18%,与商品化试剂盒和RT-PCR方法的符合率均为100%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法可以用于BRV的规模化检测,为BRV的病原流行病学调查研究提供了有效的技术手段。

双抗原夹心法ELISA在肾综合征出血热诊断中的应用

目的建立一种敏感、特异的检测肾综合征出血热(HFRS)血清总抗体的双抗原夹心法ELISA。方法应用重组汉坦病毒(HV)NP抗原e1.3S作为包被抗原和e6-119-HRP作为酶标抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测血清总抗体,并与间接免疫荧光法(IFA)相比较。结果共检测188份人血清和378份鼠血清标本,2种方法的总符合率为97.70%。以IFA为参照标准,双抗原夹心法ELISA的敏感性为97.54%,特异性为97.87%。结论双抗原夹心法ELISA检测HFRS血清总抗体具有很高的敏感性和特异性,适用于大规模的流行病学调查。

流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

使用差速离心浓缩的病毒免疫山羊,获得高免血清并提取IgG,即为抗流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)多克隆抗体。利用纯化的EHNV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经有限稀释法亚克隆,获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤接种小鼠诱生腹水获得单抗3A4。以抗EHNV多克隆抗体为捕获抗体,单抗3A4为检测抗体,使用HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗,建立了EHNV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出103TCID_(50)的病毒液上清和0.0056!g的MCP重组蛋白。对纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液进行检测,结果均为阴性,未发现交叉反应。本研究建立的EHNV抗原捕获ELISA方法,具有敏感、特异和重复性好的特点。通过应用于人工感染样品和临床样品的检测进一步证实了本检测方法的实用性。