ELOVL4基因过表达对n3和n6超长链多不饱和脂肪酸生物合成效率的影响

目的:ELOVL4是常染色体显性Stargardt氏黄斑变性的致病基因,ELOVL4蛋白酶参与n3和n6超长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acid,VLC-PUFA)的合成,比较两者的生物合成效率,对治疗Stargardt氏黄斑变性有指导意义。方法:构建携带ELOVL4基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒,转入培养的PC12细胞,将细胞分成三组:PC12、PC12+Ad-GFP和PC12+Ad-ELOVL4,前两组为对照组,通过qRT-PCR定量分析ELOVL4基因的表达量,Western Blot检测ELOVL4蛋白的表达;等浓度(1∶1)加入EPA(n3PUFA)和AA(n6 PUFA),孵育48h之后进行脂肪酸提取,通过气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析超长链脂肪酸的成分。结果:GC-MS检测到分别用EPA和AA处理后的PC12+Ad-ELOVL4的细胞中有n3 VLC-PUFA的表达,34∶5n3和36∶5n3是20∶5n3/EPA的主要产物,分别为0.71%和1.6%;34∶4n6和36∶4n6是20∶4n6/AA的主要产物,分别为0.46%和0.61%;EPA所产生的n3 VLC-PUFAs总和是AA所产生的n6 VLC-PUFAs总和的2倍。结论:在ELOVL4蛋白作用下,EPA合成VLC-PUFAs的效率高于AA,饮食中给予适当比例的n3/n6 PUFAs,可能是治疗STGD3疾病的方式之一。

Stargardt病Ⅲ型致病基因ELOVL4在脂肪酸代谢中的功能研究

背景研究证实，超长链脂肪酸延伸酶4（ELOVIA）基因是Stargardt病的致病基因，且ELOVIA可能是c≥28的超长链脂肪酸的延伸酶，而常染色体显性遗传Stargardt病Ⅲ型（STGD3）的发病可能与视网膜中c≥28的超长链脂肪酸的代谢有关。探讨ELOVL4在STGD3发病中的作用及其与超长链脂肪酸代谢的关系有望对STGD3的治疗提供新的思路。目的探讨ELOVIA基因在STGD3发病和进展中的作用及机制。方法将腺病毒（Ad）转染重组病毒质粒36h的人胚肾293细胞（HEK293）以纯化病毒，构建携带ELOVIA基因和绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺病毒载体并转人培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株（PCI2），将培养的PCI2细胞分成PCI2组、PCI2＋Ad5一GFP组和PCI2＋Ad5一ELOVL4组，根据分组情况分别将Ad-GFP和Ad-ELOVL4病毒质粒按1×10～2×10。噬斑形成单位（pfu／m1）的滴度加入含质量分数2％胎牛血清（FBS）的细胞培养液转导24h，采用实时定量PCR法（qRT—PCR）定量分析各组细胞中ELOVIAmRNA的相对表达量；采用Westernblot法检测细胞中ELOVL4蛋白的表达。分别在各组培养基中加入花生四烯酸（AA或20：4n6）、二十碳五烯酸（EPA或20：5n3）和二十二碳六烯酸（DHA或22：6n3），孵育48h后进行脂肪酸提取，通过气相色谱一质谱联用仪（GC-MS）分析各组细胞中超长链脂肪酸产物。结果PCI2＋Ad-ELOVL4组、PCI2＋Ad-GFP组和PCI2组间细胞中ELOVL4mRNA表达水平（ELOVIAmRNA／RPLl9mRNA）分别为0．833±0．138、0．027±0．002、0．024±O．002，3个组的总体差异有统计学意义（F=102．700，P=0．000），其中PCI2＋Ad5一ELOVL4组PCI2细胞中ELOVIAmRNA表达水平是PCI2组和PCI2＋Ad5-GFP组的30～40倍；Westernblot法检测结果证实，PCI2＋Ad5-ELOVIA-组PCI2细胞中ELOVL4蛋白呈阳性表达。GC-MS法检测发现PCI2＋Ad5-ELOVL4组PCI2细胞中有C28-C38多不饱和脂肪酸的合成，其中均以C34和C36多不饱和脂肪酸合成量最多。结论ELOVL4蛋白酶可催化C28-C38多不饱和脂肪酸的合成，这个结论为STGD3患者的治疗提供了新的思路。

Elovl4 mRNA在小鼠视网膜发育过程中的表达分布

目的本研究旨在观察Elovl4基因mRNA在发育期小鼠眼中的分布。方法在EST和HTGS信息库查寻Elovl4同源基因。用小鼠Elovl4探针在小鼠眼冰冻部位进行原位杂交。结果小鼠视网膜Elovl4在胚胎发育的第15天(E15)开始表达并持续到出生后各阶段。在出生后1～3天(P1-P3),Elovl4主要在视网膜神经节细胞中表达,第七天(P7)主要在视网膜外核层表达,最后的表达聚集在感光体内部节段上。结论在视网膜发育期中Elovl4的表达呈动态图谱变化。胚胎期以及出生后早期主要在神经节细胞中表达,逐步转换至后期主要在感光体内部节段上表达。

DHA与EPA合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较

目的比较在ELOVL4蛋白酶催化作用下,DHA和EPA合成超长链多不饱和脂肪酸VLC-PUFA的效率。方法构建携带ELOVL4基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒,转入培养的PC12细胞,通过qRT-PCR定量分析ELOVL4基因的表达量,WB检测ELOVL4蛋白的表达;1∶1加入DHA和EPA,孵育48 h之后进行脂肪酸提取,通过气相质谱GC-MS分析超长链脂肪酸的成分。结果 GC-MS检测到分别用DHA及EPA处理后的PC12+Ad-ELOVL4的细胞中有n3 VLC-PUFA的表达,34:5n3和36:5n3分别为0.85%和1.11%;34:6n3和36:6n3分别为0.16%和0.29%;EPA所产生的五烯酸总和是DHA所产生的六烯酸总和的4倍。结论 EPA合成VLC-PUFA的效率远远高于DHA,为患者提供更高比例的EPA,而非DHA,可能是治疗STGD3疾病的方式之一。