无融合标签的蜂毒肽在大肠杆菌中的表达纯化和抑菌研究

蜂毒肽(Melittin,MET)是一种具有抗炎和抗肿瘤作用的小分子活性肽,其可溶性表达和无融合标签活性肽的纯化一直是个难题。基于类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)的相变特性和内含肽(Intein)的自裂解特性,构建重组表达菌株Escherichia coli/pET21a-ELP-Intein-MET,在E.coli BL21(DE3)宿主细胞中实现融合蛋白的可溶性表达。重组菌破碎上清液经过温度诱导的可逆相变循环纯化以及融合蛋白自裂解的pH、温度和时间优化,在pH 7.0、30℃的条件下自裂解32 h,再经过凝胶层析纯化,得到了纯度高于95%的无融合标签的蜂毒肽。纯化后的蜂毒肽用于Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis 168和Escherichia coli JM109的抑菌研究,发现其对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌,蜂毒肽在3种菌中的最小抑菌质量浓度分别为12.5、50.0、100.0μg/mL。作者通过引入弹性蛋白和内含肽,不仅实现了蜂毒肽的高效可溶性表达,且通过较简便的蛋白质分离纯化获得无融合标签的蜂毒肽,该纯化活性肽的抑菌功能与商品化的蜂毒肽相似,有望为蜂毒肽的工业化制备提供新的思路。

ELP电力设备运输智能终端的研发及应用

ELP电力物流平台运输监测智能终端是针对ELP电力物流平台接入需求开发的智能监测终端。该终端通过内置的传感器、定位模块及4G通信模块,可以实现运输全过程状态监测、定位以及4G远传通信功能。并在实际电网项目电力设备运输中进行了成功的试点应用。通过ELP电力设备运输监测智能终端的开发和应用,响应国网公司ELP平台的应用推广需求,能够对江苏省网乃至全国网的电力物资运输过程提供监测保障服务。

多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠引起的免疫应答

目的 观察多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫Balb c小鼠引起的体液和细胞免疫应答。方法 在成功构建多房棘球绦虫elp基因原核表达载体 (pQ ELP)的基础上 ,以亲和层析法纯化重组蛋白 ,SDS PAGE鉴定 ,Bradford法进行定量。用ELP重组蛋白 (A组 )及ELP重组蛋白加弗氏佐剂 (B组 )免疫Balb c小鼠 (10只 组 ) ,以生理盐水 (NS组 )作对照。ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG2b水平。双抗体夹心ELISA试剂盒检测免疫鼠脾脏单个核细胞 (PMNC)在受到特异抗原刺激后 ,产生IL 4、IL 12和IFN γ的能力 ,3H TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增殖能力。结果 本研究成功获得高纯度重组蛋白ELP。首次免疫后 2周 ,A、B组小鼠均产生了大量的特异IgG1抗体 ,B组还产生了少量的特异IgG2b抗体。除B组小鼠脾PMNC产生了微量IFN γ外 ,A组、NS组IFN γ及各组IL 4和IL 12均未检出。A、B组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高 ,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的 2 .8和 10 .8倍 ,受到多房棘球绦虫抗原或刀豆素刺激时 ,A、B组淋巴细胞增殖更明显。结论 多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗可引起很强的体液免疫应答和微弱的细胞免疫应答 。

人Elongator复合物Elp4亚基基因可部分补偿酵母ELP4缺失菌株的生长缺陷

为研究人Elongator复合物Elp4亚基的功能 ,将人ELP4基因转入酵母ELP4基因缺失的突变菌株 (elp4△菌株 )中 ,并对转化菌株进行功能互补实验和SSA3和PHO5基因表达分析 ,结果表明人的ELP4基因不能恢复突变菌株对高盐的敏感性 ,但可以在一定程度上缓解突变菌株对高温、咖啡因 (Caffeine)和 6 氮尿嘧啶 (6 AU)的敏感性 ,部分恢复低磷条件下PHO5基因表达延迟的缺陷 ,并可在热激条件下提高SSA3基因的表达 ,因此人的ELP4基因可以部分补偿酵母ELP4基因缺失所引起的生长缺陷 ,提示人的Elp4亚基可能与酵母的该亚基功能相似。

四川株多房棘球绦虫elp基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的 实现多房棘球绦虫elp基因在原核中的表达 ,为进一步研究多房棘球绦虫ELP抗原的诊断及免疫保护性提供前提条件。方法 应用RT -PCR方法从中国四川株多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA获得elp基因编码序列 ,克隆测序后亚克隆于含有硫氧环蛋白 (Trx)基因的高效原核表达载体pET32a(+)。经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ELP/Trx融合蛋白。SDS -PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP/Trx融合蛋白 ,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果 酶切鉴定显示本研究已将elp基因编码序列插入 pET32a(+)的多克隆位点 ,成功地构建了pETrx -ELP融合蛋白原核表达载体。SDS -PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了ELP/Trx融合蛋白。检测 10份包虫病人血清均阳性 ,10份肝吸虫病、10份乙肝病人和 10份健康人血清均为阴性。结论 中国四川株多房棘球绦虫elp基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达 ,初步实验结果显示该融合蛋白对包虫病具有诊断价值。

多房棘球绦虫elp基因在真核细胞COS7中的表达

目的 构建中国四川株多房棘球绦虫 elp基因真核表达载体 ,为核酸疫苗研究奠定基础。 方法 应用 RT-PCR方法从多房棘球绦虫续绦期幼虫 RNA获得 elp基因的编码序列 ,定向克隆于 p GEM- 11zf( +)。经酶切鉴定及测序后将目的基因亚克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。重组真核表达载体 pc D- EL P鉴定后 ,纯化无内毒素的重组质粒 ,电穿孔方法转染哺乳动物细胞 COS7。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化方法鉴定目的基因在 COS7细胞中的表达。 结果 琼脂糖凝胶电泳、酶切及序列分析证实多房棘球绦虫 elp基因编码区已成功地克隆于真核表达载体 pc DNA3.1( +)。RT- PCR、dot- EL ISA和免疫组化证实 ,重组质粒在哺乳动物细胞 COS7中能够表达多房棘球绦虫 EL P抗原。 结论 成功地构建了中国四川株多房棘球绦虫 elp基因的真核表达载体 ,该载体在 COS7哺乳动物细胞中能表达 EL P抗原 ,为多房棘球绦虫 elp基因疫苗研究奠定了基础。

多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究

目的观察多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗免疫BALB/c小鼠引起的体液和细胞免疫应答。方法30只BALB/c小鼠随机分成3组:Ⅰ组,肌注空质粒(pcDNA3.1)100μg/鼠;Ⅱ组,肌注多房棘球绦虫elp基因真核表达重组质粒(pcD-ELP)100μg/鼠;NS组,肌注等体积生理盐水。每2周免疫1次,共3次。ELISA方法检测免疫后不同时间产生的特异性IgG1,IgG2a和IgG 2 b水平。双抗体夹心ELISA法检测免疫鼠脾脏单个核细胞(PMNC)在受到特异抗原刺激后,产生IL-4I、L-12和IFN-γ的能力,3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞的增值能力。结果首次免疫后4周,Ⅱ组小鼠血清可检测到特异性IgG1I、gG2a和IgG2b抗体,随免疫时间和免疫次数的增加3种特异性抗体的OD值逐渐增高,实验结束时(首次免疫后7周)3种特异性抗体OD值均最高。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾PMNC培养上清中IFN-γ浓度分别为50 pg/ml和55 pg/ml,受特异抗原刺激后分别为44 pg/ml和101.5 pg/ml。NS组IFN-γ及各组IL-4和IL-12均未检出。Ⅰ组和Ⅱ组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增高,其淋巴细胞CPM值分别为NS组的85倍和123倍,受到特异抗原或刀豆素刺激其淋巴细胞增殖更明显。结论多房棘球绦虫elp基因核酸疫苗可刺激BALB/c小鼠同时产生很强的细胞免疫和体液免疫应答。

多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中的表达及其在免疫诊断中的初步应用

目的实现多房棘球绦虫ELP蛋白在大肠埃希菌中的表达,制备高纯度、高特异性的重组抗原,为多房棘球绦虫感染的流行病学调查和临床诊断提供新的工具。方法在建立了多房棘球绦虫elp基因克隆的基础上,应用亚克隆方法将目的基因插入原核非融合表达载体pQE30(+)。经酶切鉴定,转化于大肠埃希菌,以IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。亲和层析纯化ELP蛋白,用于ELISA检测患者血清特异性抗体。结果酶切鉴定、SDS-PAGE及Westernblot分析证实,成功地构建了pQ-ELP原核非融合表达载体,该载体转化大肠埃希菌在IPTG诱导下能高效表达ELP蛋白。ELP重组抗原用于ELISA检测18份包虫病人血清均阳性,10份华支睾吸虫病、27份乙肝病毒感染者和10份健康人血清均为阴性。结论多房棘球绦虫ELP抗原在大肠埃希菌中得到了高效非融合表达,初步实验结果显示该重组蛋白对包虫病具有较高的诊断价值。

类弹性蛋白作为功能纳米材料在生物工程领域研究及应用进展

类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)是一种具有弹性功能且对温度敏感的人造蛋白质聚合物,主要由五肽重复序列单元Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n构成。ELP对温度敏感的可逆相变特征体现在低于相变温度(Transition temperature,Tt)时呈可溶状态,在高于相变温度的溶液中呈凝聚状态,此过程可逆。基于ELP标签的可逆相变循环(Inverse transition cycle,ITC)是一种新型的分离纯化重组蛋白质的非色谱技术。利用ELP融合蛋白的可逆相变特性,经过多次ITC循环从可溶的蛋白上清溶液中特异性分离出含有ELP标签的融合蛋白。该技术仅需常规的离心机就能得到与色谱法的亲和层析纯度相当的目的蛋白,成本低、操作简便,适合大规模生产的需要。ELP和ELP衍生分子具有良好的弹性、自组装性、长期稳定性和生物活性等特性,精确控制ELP的设计有利于操纵它们对外界环境的刺激反应和其他物理功能特征,ELP可调的理化性质和良好生物相容性使ELP在生物学上也具有广泛的应用。重点阐述了ELP相变特性及机理,ELP融合蛋白的设计,ELP标签对融合蛋白的影响,ELP标签在蛋白质纯化、生物医药、生物工程、水凝胶及新兴领域方面的应用,ELP发展方向及亟待解决的关键问题和技术。

人Elongator复合物Elp3亚基基因可显著补偿酵母elp3缺失菌株的生长缺陷

从HeLa细胞中分离的人的Elongator复合物在组成及与RNAPⅡ的作用方式上与酵母的E- longator复合物十分相似,但对其功能研究极少。为了研究人的Elongator复合物催化亚基Elp3的功能,将人elp3等基因转入酵母elp3基因缺失的突变菌株(elp3Δ菌株),并对转化菌株进行功能互补实验和ssa3和pho5基因表达分析,结果表明人elp3基因可显著恢复突变菌株对高温和Caffeine的敏感性,在低磷条件下显著补偿了突变株pho5基因表达延迟的缺陷,并可在热激条件下提高ssa3基因的表达。含酵母elp3非HAT区和人elp3 HAT区的融合yhelp3对上述缺陷有着更强的补偿能力。而HAT区催化结构域缺失的yhelp3HAT没有任何补偿能力,表明人Elp3亚基可能与酵母的该亚基功能相似,人Elp3的HAT活性也为其行使功能所必需。

高精度引潮力计算中地球扁率的影响

计算了地球扁率对月亮和太阳引潮力影响的量级,并对其空间分布特征、频率分布特征进行了分析,以及利用ELP2000-85星历计算了月亮引潮位中地球扁率影响项的调和展开。结果表明,引潮力中地球扁率的影响最大值接近2×10-11m s-2。引潮位调和展开结果中,振幅大于4×10-13m s-2的潮波项共有16项。

三种乳化剂对疫苗乳液稳定性的影响

采用正交试验L9(34),对F-188、ELP和TWEEN-80三种乳化剂的复配比例进行了研究.结果表明:F-188∶ELP∶TWEEN-80的比例为1∶3∶3时,疫苗乳液的稳定性最好,黏度较小,乳液颗粒直径皆在0.2μm以下,且粒径均匀.方差分析表明,3种乳化剂对乳液稳定性的影响差异极显著(P<0.01),且ELP、TWEEN-80的乳化效果极显著优于F-188.

蝌蚪状类弹性蛋白多肽相变特性分析

为研究不同盐类型及浓度对蝌蚪状ELPs_(40)相变特性的影响,探究霍夫曼斯特(Hofmeister)离子序中阴、阳离子对蝌蚪状ELPs_(40)相变温度的影响,通过设计、表达和纯化后,获得由谍标签/捕谍器(SpyTag/SpyCatcher),以及由40个重复的线性类弹性蛋白多肽所形成的2个蝌蚪型结构的ELPs_(40).结果表明:蝌蚪状ELPs_(40)相变温度比ELPs_(80)相变温度高1.35℃;阴离子对蝌蚪状ELPs_(40)相变温度的影响符合Hofmeister离子序现象,但NH4^+,K^+,Na^+等阳离子却发生逆Hofmeister离子序现象;在NaCl,Na_2SO_4,NaNO_3,K_2SO_4,KCl,KNO_3,NH_4Cl,NH_4NO_3,(NH_4)_2SO_4等不同浓度缓冲液中,蝌蚪状ELPs_(40)发生相变所需的温度范围显著高于线性ELPs_(40),这与其特殊的结构密切相关.

时钟芯片SD2200ELP与AVR单片机的接口设计

SD2200ELP是深圳兴威帆电子技术有限公司生产的高精度实时时钟芯片。本文给出了时钟芯片SD2200ELP与ATmega16的接口设计,并实现了AVR的TWI总线对SD2200ELP进行时钟和E2PROM的读/写操作的C语言程序,具有很强的实用性和通用性。

ELFP方案与ELF方案治疗晚期胃癌近期疗效和毒性的对比观察

对70例晚期胃癌分别应用ELFP方案和ELF方案化疗，其中ELFP50例，ELF20例。结果：ELFP方案有效率为66%；完全缓解率为16%；ELF方案有效率为50%，完全缓解率15%，两组相比差异有显著性（P＜0.01）。比较ELFP与ELF方案对各部位转移灶的疗效，结果表明：ELFP对腹腔淋巴结和肝转移以及伴有腹水者的疗效较好；两组毒性反应相似，病人均可耐受，但ELFP有部分患者可发生一过性腹痛和轻度肾毒性反应。

一种含ELP60基因的载体pRELPN促进大肠杆菌的外源基因的高表达

类弹性蛋白多肽(ELP)为含有人工合成的ELP60基因的表达载体pRELPN,能促使外源基因在大肠杆菌中的高表达。当ELP60在大肠杆菌表达载体p ET28a的多克隆位点被克隆后,其自身的表达低,也不与目的基因构成ELP融合蛋白质,而是促进克隆在ELP60基因后的含起始密码ATG的外源目的基因独立高表达。外源目的基因表达量占宿主蛋白的20%~60%,比用p ET28a载体表达的外源基因表达量高2~10倍。此类表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白质、多肽及ELP融合蛋白质等的外源基因的独立高表达。这些结果表明,pRELPN代表了一种有效的表达载体,有助于解决在原核表达中,所受限的普通载体对外源基因低表达或不表达所导致的不能产业化的问题。

家蚕长形卵(elp)卵壳的特异构造

用扫描电镜观察了长形卵的卵壳表面及断面构造,发现卵中央部表面构成网状卵纹的多边形小室呈长形,其长轴方向与卵的长轴方向是一致的。而其断面构造与正常卵完全相同。著者认为:这表明长形卵基因(elp)的作用影响了滤泡细胞的形状,而对其分泌机能的影响较小。同时,形成长形卵的原因,很可能就是由于滤泡细胞变长之故。另外,从卵壳构造与其生理机能来看,似乎表明:卵壳的生理机能由其断面结构所决定,而断面构造与滤泡细胞分泌机能密切相关,受其形状的影响较小。

一种快速筛选人目的基因反义片段的简单有效方法

本文选取人elp3基因三个不同的区段(基因全序列、5′端非HAT区、3′端HAT区)构建了反义质粒pRS313a1644、pRS314a1107、pRS314a450,通过与人elp3基因共转化酵母后的功能互补和基因表达检测,筛选出可显著抑制人Elp3表达的5′端非HAT区1107bp有效反义片段。该片段在随后的HeLa细胞转染实验中被检测出可显著抑制Elp3的mRNA水平,表明利用该方法可避开繁琐的细胞培养和转染步骤,快速筛选到人类兴趣基因的有效反义片段。

高精度实时时钟SD2000ELP与单片机的接口设计和编程方法

文章以MSC1210Y5单片机为例介绍SD2000ELP与单片机的接口设计和编程方法,并给出源程序清单。

ELP方法在企业信息化资源配置中的应用

根据BPR的思想,现代企业可以组建为生产部、采购部、营销部、R&D、人力资源部、财务部等六个部门.企业如何将有限信息化资源在六个部门间合理配置,使得信息化产出最优,针对这种情形,提出基于ELP方法求解信息化资源配置问题的模型,克服了传统LP方法求解的不足,该模型为企业合理配置信息化资源提供理论依据,从而有效防止企业信息化的"IT黑洞"发生.