EMAP-Ⅱ通过LKB1/AMPK/mTOR信号通路增加BTB的通透性

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对体外血肿瘤屏障(BTB)通透性的影响及可能机制。方法建立体外BTB模型,EMAP-Ⅱ处理后,millipore电阻测量系统检测跨内皮细胞阻抗(TEER)值,采用Western blot方法检测p LKB1/LKB1、p AMPK/MAPK和p-m TORC1/m TORC1的蛋白表达水平;分别应用LKB1抑制剂radicicol、AMPK抑制剂compound C和m TORC1激活剂IGF1进行预处理后再给予EMAPⅡ,检测体外BTB模型的TEER值,Western blot方法检测紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达水平。结果与EMAP-Ⅱ0 h组相比,EMAP-Ⅱ可明显降低体外BTB模型的TEER值,增加p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK的表达水平,降低p-m TORC1/m TORC1的表达水平,以上指标在EMAP-Ⅱ作用1 h时效果最明显;radicicol、compound C和IGF1预处理能够部分阻断EMAP-Ⅱ的作用,使体外BTB模型的TEER值及紧密连接相关蛋白ZO-1和occludin的表达水平明显增加。结论 EMAP-Ⅱ能明显增加体外BTB模型通透性,其机制可能与激活LKB1/AMPK/m TOR信号通路相关。

EMAP-Ⅱ选择性增加胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障(BTB)通透性的影响以及最佳的作用条件。方法应用免疫组织化学方法观察内源性EMAP-Ⅱ在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的分布;采用伊文氏兰(EB)法检测不同浓度外源性EMAP-Ⅱ作用后血肿瘤屏障通透性的变化。结果在正常脑组织,内源性EMAP-Ⅱ主要表达在脑微血管和神经元;在脑肿瘤组织,主要表达在肿瘤组织微血管和肿瘤细胞。不同浓度的外源性EMAP-Ⅱ可使血肿瘤屏障对伊文氏兰的通透性增加,对正常脑组织的通透性没有影响,在EMAP-Ⅱ的作用1 h时达到高峰,以后逐渐下降,12 h时基本恢复至灌注前水平;40.g/kg体重的浓度为EMAP-Ⅱ的的最适作用浓度。结论EMAP-Ⅱ能够以剂量依赖的方式选择性增加血肿瘤屏障的通透性。

EMAP-Ⅱ上调miR-429表达抑制人U87胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力

目的探讨内皮-单核细胞激活多肽-Ⅱ(EMAP-Ⅱ)对人U87胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及可能的机制。方法培养人U87胶质瘤细胞,给予EMAP-Ⅱ处理不同时间后,采用CCK-8检测细胞活力的变化;应用real-time PCR方法检测mi R-429在人U87胶质瘤细胞中的表达变化;利用Lipofect AMINETM2000将antimi R-429及其阴性对照转染至人U87胶质瘤细胞,再给予EMAP-Ⅱ,分别应用CCK-8法和Transwell小室法检测人胶质瘤U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结果与对照组相比,EMAP-Ⅱ显著抑制了人U87胶质瘤细胞的活力,上调mi R-429在人U87胶质瘤细胞的表达水平,上述变化在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时效果最显著;与EMAP-II作用0.5 h组相比,转染anti-mi R-429后,EMAP-Ⅱ的作用被阻断,人胶质瘤U87细胞的细胞活力,以及迁移和侵袭能力基本恢复。结论 mi R-429参与了EMAP-Ⅱ抑制人U87胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭的调控。

EMAP-Ⅱ及TNF-α炎症通路在无菌性脑炎致病机制中的作用

目的探讨内皮-单核细胞激活多肽酶Ⅱ（EMAP-Ⅱ）及TNF-α炎症通路在无菌性脑炎致病机制中的作用。方法收集2013～2014年我院确诊为无菌性脑炎的43例患者血清标本,用ELISA的方法半定量检测EMAP-Ⅱ、TNF-α的表达,用比色法测定超氧化物歧化酶（SOD）水平。比较无菌性脑炎患者治疗前后外周血中EMAP-Ⅱ的表达变化及与TNF-α、SOD水平的相关性。结果（1）无菌性脑炎患者外周血中EMAP-Ⅱ水平较正常人明显升高,并于治疗后明显下降,但仍高于正常水平;（2）无菌性脑炎患者外周血中EMAP-Ⅱ水平与TNF-α水平呈明显正相关,与SOD水平呈明显负相关。结论 EMAP-II及TNF-α炎症通路可能参与了无菌性脑炎的致病。

内皮-单核细胞激活多肽对人U118胶质瘤细胞自噬的影响及机制

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对人U118脑胶质瘤细胞自噬的影响及可能机制。方法 EMAP-Ⅱ处理人U118胶质瘤细胞后,采用MTT检测细胞活力;用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)在U118细胞的分布;Western blot方法检测LC3-Ⅱ、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平。结果与EMAP-Ⅱ0 h组相比,0.05 nmol.L-1剂量以上的EMAP-Ⅱ可明显抑制人U118胶质瘤细胞的活力,降低线粒体膜电位(MMP),在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时效果最明显;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能够阻断EMAP-Ⅱ的作用,使细胞活力和线粒体膜电位基本恢复;EMAP-Ⅱ作用0.5 h后自噬标记物LC3在胞质内呈点状分布,荧光表达明显增强,并且LC3-Ⅱ的蛋白表达水平明显上调;同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1的表达下降;此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平明显上调。结论 EMAP-Ⅱ能明显抑制人U118胶质瘤细胞活力,诱导U118细胞发生自噬,其机制可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关。

小剂量EMAP-II诱导U251细胞凋亡和自噬性死亡

目的研究小剂量内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-II)对人U251胶质瘤细胞凋亡和自噬的影响。方法培养人U251胶质瘤细胞,给予小剂量EMAP-II,或者给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和广谱caspase抑制剂zVAD-fmk预处理后再给予小剂量EMAP-II,应用MTT法检测细胞活力;小剂量EMAP-II作用不同时间后,应用Hoechst33342染色观察U251细胞的凋亡程度;应用免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链-3(LC3)在U251细胞的分布;Western blot方法检测bcl-2、bax和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。结果与对照组相比,小剂量EMAP-II显著抑制了人U251胶质瘤细胞的活力,在EMAP-II作用0.5h时效果最显著;然而,3-MA和zVAD-fmk均能显著增强U251细胞活力,二者联合应用后细胞活力恢复至对照组水平;EMAP-II作用后可见U251胶质瘤细胞核染色质凝聚、边缘化;同时伴有bcl-2蛋白表达的显著降低和bax蛋白表达的显著增强;自噬标记物LC3在胞浆内呈点状分布,荧光表达显著增强,并且LC3-II的蛋白表达水平显著上调。结论小剂量EMAP-II能够显著抑制人U251胶质瘤细胞活力,诱导人U251胶质瘤细胞的凋亡和自噬性死亡。

局部亚低温干预对大鼠脑缺血再灌注后内皮-单核细胞激活多肽表达的影响

目的通过观察局部亚低温干预对大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带区内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ（EMAPⅡ）、EMAP1I前蛋白（proEMAP11）表达的影响，从而探讨局部亚低温干预的脑保护机制。方法共选取雄性Wistar大鼠44只，采用随机数字表法将其分为假手术组、常温组及亚低温组。采用改良Longa线栓法将常温组及亚低温组大鼠制成大脑中动脉缺血再灌注模型，亚低温组于再灌注后立即给予亚低温干预（持续治疗6h）。于脑缺血再灌注后6h、12h、24h、48h及72h时处死大鼠并取脑，采用HE染色观察各组大鼠神经细胞受损情况，采用免疫组化染色法比较各组大鼠缺血脑组织EMAPⅡ、proEMAPⅡ阳性细胞表达情况。结果常温组及亚低温组EMAPII阳性细胞均于缺血再灌注6h时明显表达，于再灌注24h时达到峰值，随后逐渐下降；2组大鼠proEMAPⅡ阳性细胞均于缺血再灌注6h时明显表达，之后亚低温组逐渐下降，常温组于再灌注12h达到峰值后开始下降，至再灌注72h时2组大鼠proEMAPⅡ阳性表达均已接近假手术组水平。亚低温组EMAPⅡ阳性表达在脑缺血再灌注6h、12h、24h、48h及72h时均较常温组显著减少（P〈0．05）。常温组proEMAPⅡ阳性细胞数量在脑缺血再灌注6h、12h及24h时均较亚低温组明显增多。结论局部亚低温干预能减弱大鼠缺血半暗带区EMAPⅡ、proEMAPⅡ阳性表达，抑制缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡及炎性反应，从而发挥神经保护作用。