AKT信号通路在克唑替尼诱导的EML4-ALK阳性肺癌细胞凋亡迁移中的作用及机制研究

目的探讨AKT信号通路在克唑替尼诱导的EML4-ALK阳性肺癌细胞凋亡迁移中的作用及机制研究。方法培养人肺癌细胞株H2228,CCK8实验检测20、40、80、160、320、640 nmol/L的克唑替尼作用于细胞48 h后对细胞增殖的影响,计算半抑制浓度(IC50);300 nmol/L克唑替尼处理细胞24、48、72 h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell小室检测细胞迁移数;Western Blot检测Bcl-x L、Bcl-2、Bim、AKT、p-AKT蛋白表达。结果克唑替尼能明显抑制人肺癌细胞株H2228增殖(P﹤0.01),根据IC50值选择300 nmol/L克唑替尼为研究对象;克唑替尼能明显促进细胞凋亡,抑制细胞迁移(P﹤0.01);克唑替尼能下调Bcl-x L、Bcl-2、p-AKT蛋白表达,上调Bim蛋白表达(P﹤0.01)。AKT蛋白表达水平在克唑替尼作用的各个时间点间比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论克唑替尼通过AKT信号通路抑制人肺癌细胞株H2228迁移,并通过调节Bcl-x L、Bcl-2、Bim蛋白表达促进细胞凋亡。

RAS突变在EML4-ALK阳性肺癌联合治疗中的作用

·研究一：驱动基因的陆续发现，提示人类肿瘤的发生与环境暴露有关。·研究二：体外实验表明RAS—MAPK通道的活化与ALK抑制剂耐药相关；合理的联合靶向治疗可能对EML4-ALK融合阳性肺癌获得性耐药有抵抗作用。

EML4-ALK、BRCA1基因多态性对晚期非小细胞肺癌EGFR-TKIs治疗疗效及患者预后的影响

目的探讨EML4-ALK、BRCA1基因多态性对晚期非小细胞肺癌EGFR-TKIs治疗疗效及患者预后的影响。方法选取晚期非小细胞肺癌患者共83例,检测所有患者的EML4-ALK及BRCA1基因类型,对比各基因型患者的疾病控制率以及1年内的生存情况。结果所有患者共检测出EML4-ALK阳性10例,其中V1型7例、V2型3例。所有患者的BRCA1分型包括:Ser/Gly 50例、Ser/Ser 20例、Gly/Gly 13例。EML4-ALK阳性患者的疾病控制率与阴性患者无明显差别(P>0.05)。各BRCA1基因型患者的疾病控制率由高到低依次为Ser/Gly、Ser/Ser、Gly/Gly(P<0.05)。EML4-ALK阳性患者的1年无进展生存率以及1年总生存率与EML4-ALK阴性患者比较无明显差别(P>0.05);BRCA1基因的3种分型患者两两比较显示,Ser/Gly患者的1年无进展生存率高于Ser/Ser及Gly/Gly患者(P<0.05),Ser/Ser及Gly/Gly患者的1年无进展生存率比较无明显差别(P>0.05)。Ser/Gly患者的1年总生存率高于Ser/Ser患者(P<0.05),而与Gly/Gly患者比较无明显差别(P>0.05);Ser/Ser患者的1年总生存率与Gly/Gly患者比较无明显差别(P>0.05)。结论EML4-ALK阳性不会影响EGFR-TKIs对晚期非小细胞肺癌患者的治疗效果及预后,BRCA1基因多态性可影响晚期非小细胞肺癌EGFR-TKIs的治疗效果及患者预后。

克里唑蒂尼:晚期EML4-ALK阳性非小细胞肺癌患者的潜在标准治疗

EML4-ALK为棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule associated protein-like4,EML4)和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)的融合基因,自在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)首次被发现以来受到越来越多的关注,EML4-ALK最常见于从不/轻度吸烟的肺腺癌患者,EML4-ALK阳性NSCLC代表了NSCLC患者一个独特的亚型。所有EML4-ALK变体(variant)均具有生物学功能,其表达产物为嵌合酪氨酸激酶,可持续性促进细胞增殖,导致肿瘤的发生和转移。以EML4-ALK为靶点的ALK抑制剂克里唑蒂尼(crizotinib)治疗该亚型晚期NSCLC效果较佳。未来的挑战是寻找最佳的EML4-ALK检测方法,能简单、快速、灵敏和准确地鉴定出EML4-ALK阳性晚期NSCLC患者,以促使克里唑蒂尼早日成为晚期NSCLC患者的一线标准治疗。本研究对EML4-ALK在NSCLC患者中的突变情况、EML4-ALK的检测方法及克里唑蒂尼在治疗NSCLC中的潜在价值与临床应用进展作一综述。

Crizotinib治疗EML4-ALK阳性晚期非小细胞肺癌的临床转化研究

棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule associated protein like 4,EML4)间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase,ALK)融合基因(EML4-ALK)是近年来新发现的癌变驱动基因,该融合基因阳性的非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)患者有其独特的临床特征,可能与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)耐药相关。针对EML4-ALK基因突变的新靶向药物———ALK抑制剂crizotinib,现已经进入Ⅲ期临床试验。Ⅰ期及Ⅱ期临床试验均证实,crizotinib治疗EML4-ALK阳性晚期NSCLC患者有效,能够改善肿瘤患者症状,患者的无进展生存期(progression free survival,PFS)延长,总体有效率(overall response rate,ORR)提高。且crizotinib的毒性作用较小,与传统化疗相比,患者耐受性较好。与其他TKI一样,crizotinib也存在获得性耐药现象,其耐药机制有待进一步研究。本文就crizotinib从基础研究向治疗EML4-ALK阳性晚期NSCLC患者临床应用的转化过程作一回顾。

非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因阳性表达患者的临床研究进展

肺癌发病率近年来不断上升。2014年,中国最新研究解析了2010年中国恶性肿瘤流行病谱,报告指出中国恶性肿瘤发病与死亡均居首位的是肺癌,每年新发与死亡病例分别约60万和49万[1]。对于多数肺癌晚期患者,含铂化疗方案作为主要治疗策略,患者的中位生存期也仅10个月左右[2]。新近发现的EML4-ALK融合基因突变作为NSCLC最新的分子亚型之一,目前的文献显示其突变率约占5%,相当于每年全球约有60，000患者患此病。

3例肺癌转移灶EML4-ALK融合基因阳性患者的临床特征分析

临床资料 患者,女,71岁。2012年9月患者无意中发现左小腿中段内侧一黄豆大小包块,触痛明显,伴皮肤肿胀,无皮温增高。在当地医院给予理疗后肿胀有所好转,但肿块进行性增大伴疼痛加剧。2013年3月在当地医院行左下肢MRI检查示：左胫骨中段骨质破坏伴软组织肿块,初步诊断为恶性骨肿瘤。随后在硬膜外麻醉下行肿物切除术,术后病理提示：转移性低分化腺癌,免疫组化：CK7（＋）,TTF-1（＋）,CK5/6-,提示肺来源肿瘤可能性大。

非小细胞肺癌患者eml4-alk基因检测及eml4-alk阳性患者临床特征分析

目的探讨棘皮动物微管相关蛋白4(eml4)与间变性淋巴瘤激酶(alk)融合基因阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的检测、临床特征、治疗、预后以及与egfr、kras、braf基因表达情况之间的联系。方法选取190例NSCLC患者石蜡包埋(FFPE)标本,采用免疫组化(IHC)法进行eml4-alk融合基因阳性NSCLC患者(eml4-alk+NSCLC)筛选,对于IHC阳性的标本使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测验证。收集整理eml4-alk+NSCLC的临床资料,并对其随访;对所有患者标本采用RT-PCR法进行egfr、kras、braf突变检测。结果190例NSCLC患者中,经IHC筛查及RT-PCR确证,共检出17例eml4-alk+NSCLC,其中手术标本最多,占47.1%(8/17)(χ~2=25.999,P=0.000),<60岁的占76.5%(13/17)(χ~2=5.813,P=0.016)。未显示eml4-alk融合基因与egfr、kras或braf突变同时出现的患者。在手术患者Ⅰ期未显示eml4-alk阳性肺癌,在Ⅱ~Ⅲa期检出8例eml4-alk阳性肺癌,经术后化疗25%(2/8)复发,2年生存率为100%。9例晚期eml4-alk阳性肺癌患者化疗有效率低(4疗程化疗后仅12.5%缓解),已有5例死亡。一线化疗后病情稳定或缓解的患者维持阶段口服克唑替尼的客观缓解率(ORR)与疾病控制率(DCR)分别达50%、100%。多线治疗后进展患者三线口服克唑替尼2个月ORR与DCR仍可达33.3%、66.7%。结论通过IHC筛查及随后RT-PCR可在各种病理标本中有效检出eml4-alk+NSCLC,其临床特征为<60岁的患者多见,而与性别、吸烟史等其他特征无明显关联。能够手术的较早期(Ⅱ~Ⅲa期)eml4-alk+NSCLC,接受术后辅助化疗预后较好;晚期患者一线化疗后病情稳定或缓解患者口服克唑替尼疗效较好。经多线治疗后使用克唑替尼仍然可提高其ORR及DCR,但获益有限。

克唑替尼治疗EML4-ALK阳性晚期非小细胞肺癌的临床疗效观察

目的观察克唑替尼治疗EML4-ALK阳性晚期非小细胞肺癌的临床疗效。方法 30例既往化疗失败的中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者,随机分为实验组和对照组,实验组患者15例,给予克唑替尼治疗,克唑替尼胶囊250 mg,口服,1粒/次,2次/d,早晚确定时间各服1粒,1 d剂量为500 mg。对照组15例,给予多西他赛单药化疗,多西他赛75 mg/m2,于第1天静脉滴注,21 d为1个治疗周期,化疗前1 d给予口服地塞米松8 mg,2次/d常规预处理,避免患者出现过敏反应。对比两组患者的疗效,不良反应及生存期。结果克唑替尼用于二线治疗NSCLC与化疗相比,实验组和对照组有效率分别为60.0%、20.0%;控制率分别为93.3%、53.3%,实验组具有更好的疗效及安全性。结论能否将克唑替尼应用于EML4-ALK基因阳性NSCLC患者的一线治疗,有待于大样本的临床试验进一步确定。

克唑替尼治疗EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌脑转移患者的临床观察

目的探讨克唑替尼治疗棘皮动物微管相关蛋白-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubuleassociated protein-like 4 gene and the anaplastic lymphomakinase gene,EML4-ALK)融合基因阳性非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)脑转移患者的疗效、预后和影响因素。方法回顾性分析40例EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌脑转移患者的临床资料,其中24例接受克唑替尼250mg每日两次治疗,直到疾病进展或者患者发生不能耐受的副反应。疗效用卡方检验,生存分析用Kaplan-Meier法并进行Log-rank时序检验。结果使用该靶向药物治疗的脑转移患者较未使用者中位无进展生存期显著延长,两者之间有统计学差异(P<0.05)。患者年龄、PS评分、既往有无吸烟史、使用药物前是否存在颅外转移均影响其中位无进展生存时间。结论克唑替尼作为放化疗无效的EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌脑转移患者二线治疗有一定疗效。

非小细胞肺癌中c-Met、EGFR、K-Ras和EML4-ALK基因的检测分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中肝细胞生长因子受体(c-Met)基因扩增与临床病理特征的关系以及分析c-Met与EGFR、K-Ras和EML4-ALK驱动基因的相关性。方法采用荧光原位杂交技术(FISH)检测108例NSCLC患者的c-Met基因扩增情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EML4-ALK融合基因及c-Met基因表达量,聚合酶链扩增反应(PCR)及直接测序法检测EGFR和K-Ras基因突变情况,并分析c-Met基因与临床病理特征的关系及其与EGFR、K-Ras和EML4-ALK驱动基因的关系。结果 NSCLC中c-Met基因扩增率为1.85%,其在吸烟和非吸烟患者中扩增率分别为2.94%和1.35%;腺癌c-Met基因扩增率为1.23%,鳞癌未发现c-Met基因扩增;仅Ⅰ期和Ⅲ期中分别有1例c-Met基因扩增。NSCLC中EGFR、K-Ras基因突变及EML4-ALK融合基因的阳性率分别为42.59%、5.56%和12.04%。结论 FISH法对c-Met基因扩增检出率与qRT-PCR检测的c-Met基因表达水平基本一致;c-Met基因扩增与EGFR、K-Ras突变及EML4-ALK融合基因之间几乎是不共存的,c-Met扩增与NSCLC患者年龄、性别、吸烟状态、肿瘤组织类型及临床分期无关。

克唑替尼靶向治疗非小细胞肺癌疗效及EML4-ALK的表达情况分析

目的探讨克唑替尼靶向治疗非小细胞肺癌患者对EML4-ALK的表达的影响。方法选取2010年2月-2016年3月在我院接受治疗的EML4-ALK阳性非小细胞肺癌患者的临床资料。根据其治疗方式分为传统化疗组和克唑替尼靶向治疗组,克唑替尼靶向治疗组在传统化疗的基础上给予克唑替尼靶向治疗。观察治疗6个月后两组患者EML4-ALK阳性表达率和肿瘤标志物水平的变化,比较两组患者1年生存率的差异,分析EML4-ALK阳性表达率与肿瘤标志物水平和生存率的相关性。结果两组患者治疗前EML4-ALK阳性表达率均为100%,治疗后,靶向治疗组EML4-ALK阳性表达率低于传统化疗组(P<0.05);两组患者治疗前的CEA、NSE和CYFRA21-1等肿瘤标志物水平无明显差别,治疗后,靶向治疗组低于传统治疗组(P<0.05);靶向治疗组1年生存率明显高于传统化疗组;患者的EML4-ALK阳性表达率与CEA、NSE、CYFRA21-1明显正相关,与生存率明显负相关。结论克唑替尼靶向治疗可明显降低非小细胞肺癌患者的EML4-ALK阳性表达率,提高其生存率。

浙江省非小细胞肺癌患者EGFR基因与EML4-ALK融合基因突变的检测及其临床特征

目的 :检测中国人非小细胞肺癌表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因和棘皮动物微管相关蛋白样-4与渐变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因的突变情况,同时分析这两种基因与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)临床病理特征的关系。方法 :采用PCR扩增和基因测序法检测252例NSCLCs EGFR基因外显子19和21的突变情况,real-time PCR法检测EML4-ALK融合基因的突变情况,分析突变与临床特征的关系。结果:252例非小细胞肺癌组织标本EGFR的突变率为38.8%(98例),其中19外显子突变率为15.8%(40例),21外显子突变率为23.0%(58例)。EGFR突变的患者多为女性、无吸烟史和腺癌(P<0.05),与患者年龄无关(P>0.05)。252例非小细胞肺癌组织标本中,EML4-ALK融合基因突变率4.7%(12例)。EML4-ALK基因突变患者多为女性和年龄较小者(P<0.05),与患者吸烟史和病理类型无关(P>0.05)。没有检测到EGFR和EML4-ALK的突变共存情况。结论:中国人中NSCLCs的EGFR突变率较高,在使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗前进行EGFR基因突变检测很有必要。EML4-ALK基因突变代表了NSCLC另一种分子亚型,这为临床NSCLC患者的治疗提供了一种新的选择方案。EML4-ALK融合基因突变与EGFR突变共存是罕见的现象。

Bim在克唑替尼诱导EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌细胞株H2228凋亡中的作用机制

目的探讨Bim在克唑替尼诱导EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌细胞株H2228凋亡过程中的作用机制。方法在不同时间点(24、48、72h)用不同浓度克唑替尼分别处理EML4-ALK阳性肺腺癌H2228细胞株和EML4-ALK阴性肺癌A549细胞株,采用MTT法检测克唑替尼作用72h的细胞增殖抑制情况;PI单染流式细胞仪检测经300nmol/L克唑替尼作用24、48和72h的细胞凋亡率;采用Western blotting法检测克唑替尼诱导前后Bim蛋白(Bim-EL、Bim-L和Bim-S)的表达水平,同时对促凋亡分子Bid和抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-xL的蛋白水平进行联合检测;采用siRNA技术"沉默"Bim基因的表达,用流式细胞仪检测siRNA"沉默"Bim基因后克唑替尼诱导H2228细胞株的凋亡率。结果克唑替尼作用72h后,肺腺癌H2228细胞株和A549细胞株的细胞增殖抑制率均随着克唑替尼药物浓度的增加而逐渐升高,呈剂量依赖性。克唑替尼作用于H2228细胞72h的IC50值为335nmol/L。300nmol/L克唑替尼作用H2228细胞株24、48、72h后的凋亡率分别为(19.19±0.61)%、(35.47±1.17)%、(43.58±4.84)%,作用A549细胞株的凋亡率分别为(12.71±0.1)%、(18.22±0.13)%、(19.36±0.45)%。随着克唑替尼(300nmol/L)作用时间的延长,细胞凋亡率亦随之增加,并呈时间依赖性(P<0.05)。在凋亡细胞中发现Bim蛋白水平升高,以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达降低,但促凋亡蛋白Bid在不同药物浓度及时间点的表达水平无明显变化。此外,经siRNA技术"沉默"Bim基因后,克唑替尼诱导的H2228细胞株凋亡率明显降低。结论克唑替尼通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及上调Bim的表达水平来发挥其诱导细胞凋亡作用,该过程可被Bim siRNA抑制。

克唑替尼治疗EML4-ALK重排阳性患者的临床疗效

目的探讨EML4-ALK融合基因阳性与阴性非小细胞肺癌患者在应用不同治疗方案后的临床疗效。方法对有自主意愿进行EML4-ALK基因检测的21例ALK阳性、50例ALK阴性与75例未行ALK检测的非小细胞肺癌患者,对3组患者给予不同的治疗方法,并对疗效、无疾病生存期及不良反应做出统计学分析。结果对于EML4-ALK阳性患者,应用克唑替尼后的PFS明显延长,其客观缓解率为61.9%,明显高于应用化疗药物之后的客观缓解率。对比与EML4-ALK阴性及未测组的二线治疗方案,其客观缓解率及疾病控制率也有显著统计学差异。结论克唑替尼对EML4-ALK阳性患者具有更好的疗效,EML4-ALK基因重排与否对化疗药物并无影响。

EML4-ALK在非小细胞肺癌中的研究进展

EML4-ALK是肺癌诱发基因之一,属于融合基因,2007年由日本学者首次报道。在非小细胞肺癌(non-small-celllung carcinoma,NSCLC)患者中EML4-ALK表达阳性率约为3%～8%。EML4-ALK融合基因存在多种不同结构的变异体,其中3种变异体占大多数,其他变异体相对较少。目前尚无标准的、快速简便的检测EML4-ALK的方法,使其临床应用推广受到限制,有待进一步研究。新近的临床研究发现,EML4-ALK阳性率和患者是否吸烟高度相关,也与年龄、腺癌以及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和KRAS基因是否突变等因素相关。其中不吸烟或轻度吸烟的NSCLC患者EML4-ALK阳性率高达9.4%,而在吸烟的患者中其阳性率只有2.9%,两者存在显著性差异。EML4-ALK表达阳性与EGFR、KRAS突变呈负相关。在NSCLC患者中EML4-ALK表达和EGFR、KRAS突变很少同时存在。EML4-ALK的抑制剂TAE684和PF02341066等目前已进入Ⅲ期临床试验,前期研究取得了较好的疗效。EML4-ALK现已成为NSCLC治疗的新靶点,EML4-ALK抑制剂为肺癌的个体化治疗提供了新的可选择方案,也可作为不能耐受化疗的患者的治疗药物。

Ventana免疫组化检测非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因及其结果判读难点分析

目的分析Ventana免疫组织化学染色(IHC)检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EML4-ALK融合基因的突变情况。解析Ventana IHC结果判读的难点和陷阱,为此项检测的开展提供参考。方法回顾性分析695份Ventana IHC检测NSCLC标本,对部分标本进行了实时定量PCR(qRT-PCR)对照研究。结果 EML4-ALK在腺癌中的突变率为8.78%,鳞状细胞癌中的突变率为4.49%,总突变率为8.48%。10例Ventana IHC为(-)和(+)标本qRT-PCR检测为阴性;5例Ventana IHC染色(+++)标本qRT-PCR检测均为阳性;5例Ventana IHC(++)标本qRT-PCR检测1例阳性。结论 EML4-ALK融合基因主要发生在肺腺癌。Ventana IHC检测结果存在判读难点和陷阱,判读需要谨慎。EML4-ALK IHC检测阳性(++)的需要qRT-PCR或其它方法进一步证实。

非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因的检测及其临床病理特征分析

目的：检测EML4-ALK融合基因在非小细胞肺癌（NSCLC）人群中的突变率,并分析其与临床病理特征的关系。方法：采用逆转录定量PCR检测66例NSCLC患者组织标本中EML4-ALK融合基因的突变率;采用DNA扩增后直接测序的方法检测EML4-ALK阳性患者的组织标本中EGFR基因（18~21号外显子）及K-Ras基因（2号外显子）的突变情况。结果：66例NSCLC患者的组织标本中,有5例（7.6%）存在EML4-ALK融合基因阳性,这5例组织标本的EGFR（18~21号外显子）及K-Ras（2号外显子）均为野生型。5例阳性患者中,4例年龄小于总体患者的平均年龄（59±11）岁,占80%（4/5）;女性患者4例,占80%（4/5）;不吸烟患者3例,占60%（3/5）。EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者均为腺癌,1例NSCLC组织为腺泡样结构,3例组织为印戒细胞样结构,4例伴有胞内或胞外黏液。结论：EML4-ALK融合基因阳性NSCLC多见于年轻女性腺癌患者,多为伴有黏液产生的印戒细胞样结构,不同时合并EGFR和KRas突变。

EML4-ALK融合基因与非小细胞肺癌

非小细胞肺癌是危害人类生命最常见的恶性肿瘤之一,分子靶向治疗是目前治疗非小细胞肺癌最具前景的研究领域,如何选择合适的患者一直是靶向治疗的关键。EML4-ALK融合基因是新近发现主要表达于非小细胞肺腺癌中,可能与非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药相关的新靶点,本文就其发现过程以及研究现状进行综述。

非小细胞肺癌中EML4-ALK融合基因的检测及临床意义

目的:为了对非小细胞肺癌的治疗提供参考依据,分析ALK融合基因的检测及临床意义。方法:根据随机原则的相关要求从2015年1月-2018年6月在笔者所在医院治疗的非小细胞肺癌患者中抽取60例作为研究对象,所有患者均通过二代测序技术(NGS)检测病理标本中的EML4-ALK融合基因,探讨EML4-ALK融合基因表达与各病理特征及临床指标的关系。结果:研究数据显示,60例患者中EML4-ALK融合基因阳性表达率为13.33%(8/60),而且阳性表达率在病理组织类型、既往吸烟史及肿瘤分化程度间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在非小细胞肺癌患者中EML4-ALK融合基因存在过度表达的情况,这与肿瘤的发生、发展密切相关,临床应重视对其检测。