非放射性EMSA法检测AP-1蛋白DNA结合活性实验优化

目的探索一种方案简便,仪器要求较低,且有效的非放射性凝胶电泳迁移率(EMSA)的检测方法。方法以AP-1蛋白为实验对象,自制退火缓冲液合成生物素标记AP-1探针,抽提炎症大鼠脊髓背角处核蛋白(无需纯化),取10μg核蛋白与探针室温反应30 min。小型聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳后将探针湿转至正电子加强尼龙膜上,紫外交联,ECL显影。通过正常探针与变性探针的竞争实验,证明方法的可靠性。结果自制退火缓冲液成功合成生物素标记AP-1探针;炎症大鼠脊髓背角处AP-1蛋白与正常探针的结合后产生明显滞后条带,且结合力远高于变异探针。结论优化后的非放射性EMSA方案,有效降低了实验花费和仪器要求,且结果可信。

EMSA法分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclin D1的相互作用

利用蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法 (EMSA)分析STAT5信号分子与周期蛋白cyclinD1的相互作用。探针位于cyclinD1启动子区的 - 2 48到 - 2 2 0之间 ,该区域包含SATAT5与cyclinD1的结合序列TTN5AA。STAT5与cyclinD1共形成a、b两条蛋白滞后带 ,当用点突变的探针作用时 ,仅剩下滞后带a。

一种快速鉴定Femu2p-C_2H_2蛋白与TTGGGTBOX相互作用的EMSA实验法

分析了电泳迁移率(EMSA)技术研究进展及其优缺点,并在此基础上进行实验方法改进。通过检测TTGGGT Box及其突变体与Femu2p-C2H2蛋白的相互作用,探索并总结出一套快速、简便、经济适用的EMSA实验法,该方法可用于DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的特异性竞争反应分析。

大豆GmbZIP71基因的克隆及EMSA分析

通过PCR扩增的方法从大豆品种Harosoy中克隆到1个新的b ZIP基因(Gmb ZIP71),基因表达分析表明Gmb ZIP71在叶片、生长点、花、花芽、荚和根等多个器官中表达。将Gmb ZIP71构建到原核表达载体p ET29b上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,对其进行IPTG诱导。结果表明:在IPTG浓度为0.25 mmol·L-1,诱导时间为4 h,诱导温度为28℃时,重组蛋白得到表达,分子量大约为48 k Da,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,用His蛋白纯化系统回收得到Gmb ZIP71-His重组蛋白,EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验表明Gmb ZIP71重组蛋白可以在体外与ACGT顺式作用元件结合。

对组织有效实施EMSA的基本条件

ISO14000是各类组织实施环境管理的重要工具。如何依据此标准建立组织的EMS并保证其有效性,是摆在组织面前的问题。为此,本文在ISO14000系列标准的基础上结合认证实践,从四个方面探讨了组织有效实施EMSA的基本条件。

银染法用于EMSA分析检测三链核酸形成

目的 探讨银染法在三链形成的电泳迁移率改变分析 (EMSA)中的可行性 ,从而为三链核酸研究提供有效的非同位素检测方法。 方法 三链形成反应后进行 EMSA分析 ,然后用银染显示电泳形成的 DNA区带。 结果 银染法显示出三链的 EMSA滞后带 ,并揭示三链形成的平台效应。 结论 本文首次表明银染法可用于三链形成的 EMSA分析快速检测 ,且 SOX9基因内含子

播娘蒿转录因子DsCBF1突变体的构建及其蛋白质的EMSA试验分析

CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变Ds CBF1基因;然后构建p ET32a-Ds CBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化Ds CBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析Ds CBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子Ds CBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.

玉米转脂蛋白基因ZmLTP3启动子互作蛋白的筛选与鉴定

转脂蛋白(Lipid transfer protein,LTP)广泛参与植物的各种生长发育进程及逆境响应,但对其表达调控规律的研究则鲜有报道。首先鉴定了ZmLTP3基因上游启动子的核心序列,进而构建了玉米(Zea mays L.)自交系B73的cDNA表达文库,克隆了ZmLTP3基因上游启动子区域,利用酵母单杂交技术筛选,筛选ZmLTP3基因启动子序列互作蛋白。通过测序和生物信息学分析,共筛选到13个互作蛋白cDNA。其中ZmLSD1具有典型的转录因子特征,属于C4类型锌指蛋白家族成员。EMSA检测结果表明,只有ZmLSD1蛋白可以与来自ZmLTP3基因启动子的DNA探针序列结合。上述结果表明ZmLSD1能与ZmLTP3基因启动子结合,并调控其表达的转录因子。

CREB激活促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录的实验研究

目的探讨CREB激活促进神经痛大鼠脊髓背角HCN4转录的信号机制。方法雄性成年SD大鼠随机分为6组:Sham组,Sham+Vehicle组,CCI+Vehicle组,CCI+H-89(PKA抑制剂),CCI+KN-93(CaMKⅡ抑制剂),CCI+Naphthol AS-E(CREB抑制剂)。各组大鼠在CCI术后分别注射0.005%DMSO、H-89、KN-93或Naphthol AS-E,在CCI术前,术后1、3、5、7 d检测各组大鼠给药1 h后的机械刺激缩足反射阈值(MWT);实时荧光定量PCR检测HCN4 mRNA表达;Western blot检测脊髓(L_(4)~L_(6))背角HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表达;EMSA检测CREB与HCN4启动子的DNA结合活性。结果与Sham组相比,CCI+Vehicle组在1、3、5、7 d的MWT显著降低(P<0.05),脊髓背角HCN4 mRNA表达明显上调(P<0.05),HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB蛋白表达明显上调(P<0.05);与CCI+Vehicle组相比,H-89、KN-93或Naphthol AS-E抑制剂组MWT显著上调(P<0.05),HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB蛋白表达显著下降(P<0.05),HCN4 mRNA表达显著减少(P<0.05);与Sham组相比,CCI+Vehicle组背角CREB与HCN4启动子的DNA结合活性升高,但H-89、KN-93或Naphthol AS-E处理后CREB与HCN4启动子的DNA结合活性减弱。结论神经痛大鼠脊髓背角PKA和CaMKII激活,导致转录因子CREB与HCN4基因启动子结合,促进HCN4转录和蛋白表达。

抗人TNF单克隆抗体对TNF诱导的NF-κB核转位的抑制作用

目的 :鉴定 3株抗人TNF单克隆抗体 (mAb)D2、E6和F6对TNF诱导的NF κB核转位的抑制作用。方法 :将不同浓度的 3株mAb及无关mAb分别与TNF溶液孵育后 ,加入到ECV30 4细胞培养液中。孵育 1h后收获细胞 ,从中提取核蛋白并测定其含量 ,用电泳迁移率变动分析 (EMSA)检测核提取液中NF κB的核转位。结果 :3株抗TNFmAb均可抑制TNF诱导的ECV30 4细胞中NF κB的核转位。其中mAbD2的抑制作用最强 ,其次为mAbF6和E6 ,无关对照抗体也有一定的非特异性反应。抑制作用与加入的mAb呈良好的剂量依赖关系 ,在 10mg/L和 0 .1mg/L条件下 ,mAbD2的抑制率分别为 94 .2 %和75 .1% ,mAbE6分别为 6 4 .9%和 2 8.6 % ,mAbF6分别为 70 .3%和 4 9.5 % ,无关对照抗体分别为 2 0 .0 %和 11.1%。结论 :mAbD2、E6和F6可特异性地抑制TNF诱导的NF κB核转位 。

一种改进的核转录因子的电泳迁移率改变分析法

目的 建立一种简便、实用、成功率高的电泳迁移率改变分析法。方法 参照国内外介绍的实验方法并加以改进 ,并结合本室的实际情况。主要步骤为核蛋白快速抽提与定量 ,探针标记与纯化 ,DNA与蛋白质的结合 ,电泳及显影。结果 此方法操作时间较短 ,简化了核蛋白抽提 ,且省去了繁锁的干胶步骤 ,图像清晰 ,有可比性及重复性。结论 此方法本室运用过多次 ,稳定可靠 ,值得应用与推广。

大蒜素对胃癌细胞NFκB活性的影响

目的 研究大蒜素对肿瘤细胞中核转录因子B(NFκB)活性的影响 ,探讨大蒜素抗肿瘤的作用机制。方法 用凝胶滞留 (EMSA)方法分析应用大蒜素处理前后人胃癌细胞系BGC 82 3的细胞核蛋白中NFκB的DNA结合活性。结果 用大蒜素处理后可观察到肿瘤细胞有增殖减慢及诱导分化等现象 ,大蒜素处理后NFκB结合DNA的活性降低。

大豆乙烯响应因子GmERF6的功能分析

GmERF6是从大豆中克隆到的一个新的ERF转录抑制子基因,对其功能作了进一步的分析。亚细胞定位试验结果显示GmERF6蛋白定位于细胞核中;利用原核表达纯化GmERF6蛋白并进行凝胶阻滞分析(EMSA),结果显示,GmERF6蛋白在体外可以与GCC-box元件特异结合;对GmERF6转基因拟南芥干旱条件下的种子萌发率和植株表型进行观察,结果证实GmERF6提高了转基因拟南芥的抗旱性,表明该基因可作为培育抗旱材料的候选基因。

血管紧张素II对血管内皮细胞三种转录因子作用的影响

目的和方法 :分别采用凝胶迁移率改变法 (EMSA)和Western -blot的方法从基因转录水平探讨AngII对血管内皮细胞株ECV30 4的影响。结果 :(1)EMSA结果表明 ,AngII组核抽提物与 3种探针的结合活性均高于正常对照组 ,与NF -κB ,SP - 1和AP - 1探针结合活性分别为正常对照组的 10 98倍 ,3 97倍和 1 33倍 ,说明AngII对血管内皮细胞的作用机制可能与NF -κB ,SP - 1和AP - 1等转录因子的转录活性增加有关。进一步证实NF -κB ,AP -1在内皮细胞功能失调发病机制中的重要作用 ,同时发现转录因子SP - 1也可能参与此过程。 (2 )Western -blot结果表明 ,AngII处理后细胞核内NF -κB含量明显增加 ,提示AngII能够增加血管内皮细胞转录因子NF -κB的核转位 ,进一步验证了EMSA的结论。而细胞核内SP - 1和AP - 1的含量较对照组略有增加 ,提示AngII对SP - 1和AP - 1的核转位无明显影响而可能主要是促进转录因子与相应顺式调控元件的结合活性。结论 :AngII对内皮细胞 3种重要的转录因子的活性有不同程度的影响 。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定

目的检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力。方法通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象。结果成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后。结论重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式

马铃薯WRKY2基因的功能尚未见有报道,WRKY蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用。该研究采用电子克隆法获得马铃薯WRKY2基因,该基因的编码区长度1 065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第二组成员,锌指结构为C-X5-C-X23H-X-H。构建系统发育树结果表明它与番茄WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96%,与烟草中WRKY蛋白的相似性为86%,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白。通过凝胶阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合W-box元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,同时也表明St WRKY2不能结合含有突变W-box DNA片段,证明St WRKY2与W-box结合具有特异性。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在根、茎和叶中的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎。为进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L低磷、10μmol/L低钾、200 mmol/L Na Cl、400 mmol/L PEG溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定量PCR的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L Na Cl和400 mmol/L PEG处理6 h后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处理后表达量与对照相比无明显变化。说明St WRKY2能响应低磷、Na Cl和PEG这三种非生物逆境胁迫。研究结果可为进一步深入研究马铃薯WRKY2基因的功能奠定基础。

青蒿琥酯对人白血病K562细胞NF-κB活化的影响

目的:观察青蒿琥酯对白血病细胞K562核转录因子κB信号通路的影响。方法:采用Western blot法,检测青蒿琥酯对K562细胞IKKα,IKKβ,IKKγ)表达的影响,采用Western blot法,检测青蒿琥酯对K562细胞caspase 3和PARP cleavage的作用;采用EMSA法检测青蒿琥酯对白血病细胞NF-κB活性的影响。结果:青蒿琥酯能抑制核转录因子κB的表达,青蒿琥酯能够下调IKKα的表达。结论:青蒿琥酯通过下调IKKα的表达而抑制转录因子κB活化。

人成纤维细胞转录因子Sp1Sp3对p16^(INK4a)基因的调控

p16 INK4a是一种细胞周期蛋白依赖激酶 (cdk)的抑制因子 ,它通过抑制cdk4与cdk6的活性 ,使视网膜母细胞瘤抑制蛋白Rb处于低磷酸化状态 ,从而使细胞阻滞于G1期 .对p16 INK4aATG上游 6 2 2bp片段进行序列分析发现 ,该区域富含GC ,其中有 5个GC盒 (分别命名为GC Ⅰ～GC Ⅴ ) .将上述片段插入到荧光素酶报告载体pGL3 Basic ,分别对 5个GC盒进行点突变后转染人胚肺二倍体成纤维细胞 (2BS)发现 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ位点的突变体显著下调p16 INK4a启动子的活性 ,而Ⅲ、Ⅴ位点突变体无明显作用 .电泳迁移率变动分析 (EMSA)证实 ,GC Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅳ能与转录因子Sp1和Sp3结合 ,而且结合条带可被转录因子Sp1和Sp3的抗体所拮抗 .共转染Sp1有助于增加启动子的活性 ,而共转染Sp3则有较弱的抑制作用 ,证明p16 INK4a的转录受到Sp1与Sp3的调控 .

推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后发现目的蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白。利用PCR与酶切方法获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3′端进行生物素标记。最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力。结果成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中。经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合。结论成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础。

大蒜素对人白血病Jurkat细胞生长和凋亡的影响

目的探讨大蒜素对人白血病Jurkat细胞生长抑制和诱导凋亡的作用。方法用凝胶直流法(EMSA)分析大蒜素处理前后Jurkat细胞核中NF-κB的DNA结合活性。MTT比色分析法检测大蒜素对Jurkat细胞生长的抑制作用,流式细胞术分析大蒜素对Jurkat细胞凋亡的影响。结果大蒜素处理后NF-κB的DNA结合活性降低,各浓度大蒜素均能抑制Jurkat细胞生长,其抑制作用呈时间浓度依赖性。结论大蒜素对Jurkat细胞生长有抑制作用,其抑制作用与诱导Jurkat细胞凋亡有关,可能是通过NF-κB信号途径起作用。