雌雄驯鹿茸皮组织ENO1基因cDNA克隆与表达

选用雌、雄驯鹿(Rangifer tarandus)顶端茸皮组织为试验材料,参考Genebank数据库中白尾鹿(Odocoileus virginianus)、牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)等同源物种的ENO1基因序列设计同源引物,采用PCR及T-A克隆技术以雄性驯鹿茸皮组织为材料克隆ENO1基因的c DNA序列,并运用荧光定量PCR技术对ENO1基因在雌、雄驯鹿茸皮组织中的表达量进行对比分析。结果表明:成功克隆获得驯鹿ENO1基因,其编码区片段大小为1 305 bp,共编码434个氨基酸;ENO1基因编码的蛋白的相对分子质量为47 342.09,其二级结构以α-螺旋为主;Blastp比对显示,驯鹿ENO1基因与羊、白尾鹿、牛的同源性最高,均为99%。构建系统进化树发现,驯鹿ENO1基因与白尾鹿的亲缘关系最近,与白头鹰(Haliaeetus leucocephalus)的亲缘关系最远;荧光定量PCR结果显示,ENO1基因在茸皮组织中的表达量在雌、雄之间存在差异,其中在雄性驯鹿茸皮组织中的表达量是雌性驯鹿茸皮组织中的(3.35±0.12)倍。

人ENO1基因的克隆及其重组逆病毒载体ENO1-pBABE-Puro的构建

目的构建含人烯醇化酶1(ENO1)目的基因的重组逆转录病毒载体。方法从人癌细胞中提取总RNA合成cDNA,PCR扩增目的基因ENO1,用sal1和BamH1双酶切ENO1及pbabe质粒,然后用连接酶将ENO1插入pbabe中,最后将重组质粒转化感受态E.coli DH 5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。结果重组逆转录病毒载体ENO1-pBABE-Puro测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到逆转录病毒载体pBABE-Puro中。结论成功构建了含有ENO1目的基因的重组逆转录病毒载体,为进一步观察ENO1在肿瘤发生、发展中的作用及与宫颈癌细胞化疗敏感性的相关性做好准备。

α-烯醇化酶在肿瘤研究中的进展

肿瘤在形成和发展过程中涉及多种与能量代谢有关的蛋白,这些蛋白可能提供促进肿瘤生长的正向环境,也可能参与对肿瘤抵抗和清除的防御反应。α-烯醇化酶(ENO1)作为一种多功能的蛋白,参与多种生理及病理过程,与肿瘤的发生、发展相关。研究发现,ENO1在头颈部肿瘤、呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、妇科肿瘤及其他相关肿瘤中均有不同程度的表达。因此,ENO1可能成为预测某些肿瘤发生、发展、疗效及预后的辅助指标。

α-烯醇酶对胃癌细胞株MGC-803上皮间质转化的影响

目的研究α-烯醇酶(α-enolase,ENO1)对MGC-803胃癌细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的作用。方法扩增ENO1基因编码区序列,构建真核表达载体pc DNA3.1/ENO1并测序;脂质体转染胃癌细胞,以pc DNA3.1/ENO1质粒转染细胞为ENO1组,以空质粒pc DNA3.1转染细胞为对照组,Real-time PCR和Western Blot分别检测各组ENO1的mRNA及蛋白表达情况;在转染24 h收集两组细胞,Real-time PCR检测并比较EMT特异标志基因E-cadherin、Snail及Vimentin表达水平;合成特异干扰ENO1的siRNA片段,脂质体转染癌细胞,在转染24 h收集干扰组和对照组细胞,Real-time PCR检测EMT特异基因表达水平。结果 Real-time PCR结果显示,ENO1组ENO1 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05);Western Blot发现,ENO1组ENO1蛋白相对表达量也高于对照组(P<0.05)。结果发现转染24 h后ENO1组E-cadherin、Snail及Vimentin等基因的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);转染24 h后干扰组E-cadherin、Snail及Vimentin等基因的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论在胃癌细胞内过表达及干扰ENO1表达,对细胞EMT并无明显作用,ENO1对胃癌细胞功能的影响可能与EMT无关。

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础。方法以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白。结果利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白。结论成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础。