山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R^(2)=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10^(2) copies·μL^(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV<1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。

福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查

为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户中,共检测出19个阳性场户、89份阳性样品,场阳性率为47.50%,个体阳性率为8.92%;9份阳性样品的SU蛋白编码基因均与ENTV-2位于同一进化分支,其中2份阳性样品处于相对独立的分支,与ENTV-2流行株同源性约为96%,且各有5处氨基酸突变,其他阳性样品与ENTV-2流行株同源性在99%以上,氨基酸序列一致。结果表明,ENTV-2在福清市流行较为广泛,流行毒株出现了一定的变异,需要持续加强监测,采取综合措施控制该病流行。本研究有助于了解和掌握ENTV-2在山羊群中的感染情况和遗传变异特征,为提高该病防治效果奠定了基础。

基于LTE的5G地面广播技术的发展与研究

本文首先针对了国内外数字地面广播技术的发展现状,重点介绍了2018年6月3GPP RAN#80会议中所提出的5G专用地面广播的需求分析和相关技术,并对5G地面广播的典型应用场景、仿真参数、信道模型和用户设备展开了具体的分析与研究,最后对5G地面广播技术的发展和网络融合进行了展望。

山羊鼻内肿瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了解山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的流行情况,本研究针对ENTV-2的env基因设计了1对特异性引物与探针,通过RT-PCR条件优化,成功建立了ENTV-2荧光RT-qPCR检测方法。该方法特异性高、灵敏性强(5.61 copies/μL)、重复性好(CV为0.09%~1.20%)。本研究建立的一步法荧光RT-qPCR方法为ENTV-2的临床检测以及流行病学调查提供技术支撑。

5G广播技术研究分析

随着5G时代的临近,基于移动通信的地面广播技术不断受到关注,本文介绍了其发展过程、5G广播技术方案、目前产业和试验情况,分析了5G广播与传统广播电视的关系,提出了5G广播与传统广播电视协同的发展方向。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列分析及其gag基因促肿瘤发生的机制研究

本研究旨在获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)全基因组序列并进行分析。从福建某羊场的山羊鼻内肿瘤组织取样,针对ENTV-2设计引物,通过RT-PCR方法从肿瘤组织中分段扩增出6个特异性产物,测序后利用生物学软件DNAStar进行拼接,获得长度为7443 bp全基因组序列,将其命名为ENTV-2-FJ。ENTV-2-FJ基因组结构与其他逆转录病毒类似,具有5′-U5-gag-pro-pol-env-U3-3′典型结构,包含4个开放阅读框和侧翼非编码区以及末端重复序列。为制备兔抗ENTV-2 gag蛋白多克隆抗体,将特异性扩增的gag基因克隆至pET-21a(+)载体,构建重组质粒pET-21a-gag,鉴定后转化至BL21(DE3)细胞并经IPTG诱导成功表达分子量约为70 ku的融合蛋白。Western blot分析表明,制备的兔抗gag蛋白抗体能在患病山羊肿瘤组织和表达gag基因的细胞中特异性地检测出gag蛋白。为了深入研究ENTV-2-FJ致瘤机制,作者构建了过表达gag基因的K562细胞系,并进行裸鼠致瘤试验。结果显示,gag蛋白通过激活JAK2-STAT5信号通路促进肿瘤的生长。综上,本研究获得了ENTV-2-FJ全基因组序列并对其进行分析,制备并验证了gag蛋白的多克隆抗体,揭示了gag蛋白的作用机制,这些结果为阐明ENTV-2的致病机制提供了科学依据。

云南省江城县山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测及序列分析

为了解云南省山羊群中的地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus,ENTV)感染情况,2017年在云南省南部边境地区江城县采集山羊血分离血浆,采用随机PCR(random PCR)进行扩增、克隆,结果从20份血浆中获得与ENTV 2型(ENTV-2)同源性较高的2条序列;根据ENTV-2 CHN1(KU258870)毒株序列设计一套半巢式引物,对采集的20份血浆进行核酸检测,结果4份为阳性。序列分析发现,检测到的4条序列与四川、福建等地流行的ENTV-2位于同一个进化分支,它们之间的核苷酸同源性为96.3%~99.5%,氨基酸同源性为95.3%~99.0%,提示江城县羊群中流行的ENV-2可能与四川省、福建省流行毒株相关;位点分析结果显示,江城县的这4份ENTV-2核酸阳性样品在env蛋白186和204位发生了独特的“G→E”氨基酸位点突变,其中1份在178位还发生了“T→P”的氨基酸位点突变。结果表明,江城县山羊群中存在ENTV-2感染,且流行的ENTV-2呈现一些特有的分子特征。因此,云南省需要加强ENTV监测,了解其在山羊群中的流行情况及其演变规律。本研究为进一步开展ENTV感染调查和山羊呼吸道疾病的诊断和预防提供了依据。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SC株gag基因分子克隆与原核表达

克隆山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)的群抗原基因gag,并通过原核表达系统对gag进行表达研究。参照GenBank中收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)gag基因序列设计1对特异引物,以地方性鼻内腺癌(ENA)山羊鼻内分泌物中病毒RNA为模板,RT-PCR扩增获得目的片段,并将产物连接到pMD18-T载体获得阳性克隆(pMD18-gag)并测序。根据gag基因的ORF设计1对表达用引物进行亚克隆,并将ORF重组到pET-32,重组质粒转化至宿主菌Rostta中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE分析,纯化表达产物,通过ELISA初步分析产物的反应原性。结果显示:克隆获得长2 249 bp的核酸序列(GenBank:HM104174),含有完整的ORF,与已报道的ENTV-2 gag基因的同源性高达87%,氨基酸水平上的同源性高达96.4%。表达产物大小约87 ku,与理论推理一致。采用ELISA方法检测表达产物未能与ENA阳性血清发生特异性反应。结果表明:gag基因在原核系统pET-32/Rostta中得到表达,表达产物与ENA阳性血清不具反应原性。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。