NF-κ Bp65基因siRNA腺病毒载体的构建及其对EOMA细胞的影响

目的构建含NF-κ Bp65基因siRNA腺病毒载体,并研究其对小鼠血管瘤细胞EOMA中NF-κ Bp65基因表达的影响。方法首先构建含有NF-κ Bp65 shRNA的人H1启动子真核表达载体pSuperH1/shp65,利用NotⅠ与SalⅠ双酶切将人H1载体启动子和NF-κ Bp65 shRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle中,形成转移质粒pShuttle-H1/shp65,然后转化含有pAdeasy的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒Ad-shp65,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染小鼠血管瘤细胞EOMA,采用RT-PCR和荧光定量PCR检测感染前后NF-κ Bp65表达水平的变化,观察Ad-shp65对EOMA中NF-κ Bp65表达的影响。结果成功构建NF-κB p65 siRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制EOMA细胞中NF-κ Bp65的表达。结论构建的Ad-shp65腺病毒能有效抑制NF-κ Bp65基因在小鼠血管瘤细胞中的表达,为研究异种移植延迟性排斥反应提供了新的方法。

油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的抑制作用

目的:探讨油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的抑制作用。方法:选择小鼠血管瘤EOMA细胞作为实验对象,不同浓度油茶皂苷作用于EOMA细胞,采用CCK8法、AO染色及流式细胞术分别检测细胞增殖水平、细胞凋亡率及细胞周期分布。结果:油茶皂苷作用EOMA细胞24 h后,CCK8法检测油茶皂苷对EOMA细胞体外增殖能力有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。吖啶橙(AO)染色后荧光显微镜下观察可见细胞数量明显减少,细胞体积缩小,细胞核固缩,计数,与对照组相比,油茶皂苷20 mg·L^(-1)组、40 mg·L^(-1)组凋亡率分别为9.5%、14.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。经流式细胞仪检测,与对照组相比,油茶皂苷20 mg·L^(-1)组、40 mg·L^(-1)组细胞G0/G1期比例增加而S期比例降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:油茶皂苷可一定程度抑制血管瘤EOMA细胞的增殖,其作用机制可能是通过诱导EOMA细胞凋亡,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制其增殖转化。

干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响

目的探究干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响.方法体外培养血管瘤EOMA细胞,并分为空白对照组、阴性对照组、目的基因组,利用干扰RNA敲除MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达,使用RT-PCR方法检测MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达;使用Edu染色检测缺失RNA MALAT1后对细胞生长的影响,使用流式法检测血管瘤EOMA细胞凋亡情况,使用transwell检测血管瘤EOMA细胞侵袭情况;Western印迹检测血管瘤EOMA细胞中Ki67、PC-NA、caspase-3、caspase-9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达情况;小鼠皮下注射EOMA细胞建立移植瘤模型,使用RT-PCR检测长链RNA的表达,检测shRNA敲除Lnc对肿瘤重量的影响,统计分析小鼠生存期,使用免疫组化检测Ki67和N-cadherin的表达情况.结果与空白对照组比较,阴性对照组MALAT1、Ki67、PCNA、caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达、细胞生长、运动情况均无显著差异(P>0.05),与阴性对照组比较,目的基因组大鼠血管瘤EOMA细胞中MALAT1表达、EOMA细胞侵袭百分比、Ki67、PCNA和N-cadherin蛋白表达水平显著降低;EOMA细胞凋亡百分比、caspase-3、caspase-9和E-cad-herin蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);小鼠体内实验发现,与阴性对照组比较,目的基因组小鼠体内肿瘤质量、Ki67和N-cadherin阳性表达率显著降低,小鼠miR-377-5p表达水平、生存期显著增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论干扰长链非编码RNA MALAT1可以有效地抑制血管瘤EOMA细胞的生长、运动,促进其凋亡.

普萘洛尔对小鼠血管瘤细胞体外增殖及凋亡的影响

目的:通过β受体阻滞剂普萘洛尔作用于小鼠EOMA血管瘤细胞体外增殖及凋亡的实验研究,初步探讨普萘洛尔治疗血管瘤的机制。方法:体外培养EOMA细胞,使用不同浓度普萘洛尔分别作用于EOMA细胞24、36、48 h,应用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、吖啶橙染色检测细胞凋亡情况,观察普萘洛尔对EOMA细胞体外增殖和凋亡的影响。结果:作用24 h后,随剂量增加,EOMA细胞存活率逐渐下降,与对照组相比,至药物浓度为75μmol/L时有显著差异(P<0.05),继续增加至800μmol/L时,细胞存活率接近0,同时吖啶橙染色示凋亡细胞逐渐增多,与对照组相比,至药物浓度75μmol/L时,细胞凋亡率有显著差异(P<0.05)。36 h组和48 h组变化趋势与24h组相似。结论:普萘洛尔在体外可有效抑制小鼠EOMA血管瘤细胞的增殖并促进其凋亡,这一作用呈现明显的剂量-时间效应依赖性。

shRNA干扰技术沉默VEGF表达治疗血管内皮瘤的实验研究

目的构建血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA真核表达质粒(shVEGF),观察其对血管内皮瘤细胞系(EOMA)细胞体外增殖及动物实验的影响。方法构建真核表达质粒pGenesil-3-shVEGF并转染EOMA细胞,采用CCK-8法检测shVEGF对EOMA细胞增殖能力的影响。建立EOMA细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组和shVEGF组,肿瘤出现后,隔日测量瘤体体积,并观察体积变化。结果转染48h后EOMA细胞增殖受到抑制。体内实验显示经shVEGF治疗后,裸鼠皮下移植瘤体生长缓慢,体积明显缩小。结论RNA干扰技术实现VEGF基因沉默,能明显抑制EOMA细胞增殖及体内肿瘤生长,提示shVEGF在血管内皮瘤、血管瘤等血管瘤样病变的生物治疗中可能有较好的应用前景。