恩格列净通过上调Epac1表达抑制炎症反应减轻2型糖尿病大鼠肾损伤

目的 观察恩格列净(EM)对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾损伤的治疗效果,并探讨其可能存在的机制。方法 将SD雄性大鼠随机分为正常对照(NC)组、 T2DM组和EM组,每组6只。T2DM组和EM组,给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立T2DM模型,记录各组大鼠空腹血糖(FBG)和体质量。EM组给予EM溶液灌胃,其余两组予以等量的羧甲基纤维素钠溶液灌胃,给药12周。记录大鼠体质量和FBG后处死大鼠,留存腹主动脉血液和肾脏组织。全自动生化分析仪检测血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC);行Masson染色、过碘酸希夫(PAS)染色、 HE染色观察肾脏组织学变化,透射电镜观察肾脏超微结构变化;免疫组织化学染色法检测大鼠肾脏组织中环磷酸腺苷直接激活的交换蛋白1(Epac1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)的表达和分布。结果 与NC组相比,T2DM组大鼠体质量下降,FBG、 Scr、 BUN、 UA、 TC、 TG水平明显升高;肾小球基底膜增厚,足细胞足突融合,排列紊乱,内皮细胞窗孔消失;Epac1蛋白表达水平下降,TNF-α、 IL-1β、 IL-18的蛋白表达水平明显增高。与T2DM组相比,EM组大鼠体质量上升,FBG、 Scr、 BUN、 UA、 TC、 TG水平降低;肾损伤减轻,Epac1蛋白表达水平升高,TNF-α、 IL-1β、 IL-18的表达显著降低。结论 EM能够改善T2DM肾损伤。这种治疗效果是通过上调Epac1蛋白表达,抑制炎症反应介导的。

Epac1对垂体腺瘤细胞增殖和细胞周期的影响及分子机制研究

目的探索垂体生长激素腺瘤细胞增殖的分子机制。方法收集12例肢端肥大症患者的功能性生长激素垂体腺瘤(fGH-PA)组织样本。qPCR法测定fGH-PA组织和大鼠RGC-5、MMQ、GH3细胞中cAMP直接激活的交换蛋白1(Epac1)mRNA表达水平。免疫组织化学测定fGH-PA组织中Epac1蛋白表达情况。Western blot测定MMQ、GH3细胞中Epac1蛋白表达情况。在GH3细胞中过表达或敲低Epac1,或敲低cAMP反应元件结合蛋白(CREB),流式细胞术测定细胞周期变化;CCK-8法测定细胞增殖能力;Western blot测定细胞内p-CREB、CREB、Cyclin D1、CDK2、p21的表达情况。结果qPCR和免疫组织化学结果显示,与旁侧正常组织相比,fGH-PA组织中Epac1 mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。qPCR和Western blot结果显示,与RGC-5细胞相比,MMQ和GH3细胞中Epac1 mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。在GH3细胞中过表达Epac1后,与Control组相比,Epac1-OE组G0/G1期和S期细胞占比明显减少(P<0.05),G2/M期细胞占比明显增多(P<0.05);细胞增殖能力明显增强(P<0.05);细胞内p-CREB和Cyclin D1的表达水平明显升高(P<0.05),CDK2和p21的表达水平明显降低(P<0.05),而CREB的表达水平无明显变化(P>0.05)。在GH3细胞中敲低Epac1或敲低CREB后,上述所有结果均发生逆转(P>0.05)。结论垂体生长激素腺瘤细胞中Epac1过表达能够上调细胞内p-CREB的水平,并促进腺瘤细胞通过G1/S期检查点,发生细胞周期检查点失调和大量增殖,但不影响CREB的表达水平。

人参皂苷Rg1调控Epac1/Rap1信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经保护作用机制研究

目的:研究人参皂苷Rg1对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用并探究其作用机制。方法:将84只13周龄左右的SPF级SD雄性大鼠随机分为7组(n=12):假手术组、模型组、Rg1低剂量组、Rg1中剂量组、Rg1高剂量组、Epac1激动剂组、Epac1抑制剂组。模型组、Rg1低、中、高剂量组、Epac1激动剂组、Epac1抑制剂组均采用线栓法建立永久性局灶脑缺血大鼠模型。Rg1低中高剂量组大鼠每天上午固定时间进行灌胃给药,Rg1低剂量组、Rg1中剂量组和Rg1高剂量组分别使用60、120、240μmol/L Rg1处理;Epac1激动剂组和Epac1抑制剂组大鼠每天上午固定时间进行腹腔注射给药,Epac1激动剂8-CPT使用浓度为1.0×10^(4)μmol/L,抑制剂ESI-09使用浓度为1.0×10^(5)μmol/L。连续给药两周后,将各组大鼠施以断头处死。分别采用TTC染色、尼氏染色、TUNEL染色、微量酶标法、Western blot法检测各组大鼠脑梗死体积、完整神经元数目、氧化损伤指标、细胞凋亡情况,以及NOX2、Epac1、Rap1、caspase3的蛋白表达水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠脑梗死体积明显增大,脑组织中完整的神经元数量明显减少,脑组织中神经元氧化损伤明显加重,神经细胞凋亡率明显升高,NOX2、Epac1、Rap1、Caspase3蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,Rg1低、中、高剂量组和Epac1抑制剂组大鼠脑梗死体积明显减少,脑组织中完整的神经元数量明显增多,神经细胞凋亡率明显降低,NOX2、Epac1、Rap1、Caspase3蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1可以调控缺血性脑卒中后的Epac1/Rap1信号通路,减轻脑神经元的氧化应激,从而减轻神经功能损害,发挥对神经细胞的保护作用。

牡荆素调控Epac1/CaMKⅡ通路减轻小鼠急性心肌缺血再灌注损伤的作用机制

目的研究小鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中Epac1/CaMKⅡ信号通路的作用,并探明牡荆素(VT)对急性MIRI的保护作用。方法取C57/BL小鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组(Sham组),缺血再灌注组(I/R组),缺血再灌注+VT组(VT设置3、6、12 mg/kg 3个剂量组)。小鼠左冠状动脉前降支(LAD)结扎,使部分心脏组织缺血30 min,血液再灌注120 min,构建小鼠MIRI模型。Sham组小鼠只手术不结扎LAD。检测小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)水平;取小鼠左室心肌组织进行HE染色观察心肌病理组织学变化;免疫组织化学观察心肌组织中Epac1的表达水平;Western blot法测定Epac1、Rap1、CaMKⅡ、ERK/p-ERK蛋白表达的变化。结果与Sham组比较,I/R组小鼠血清中LDH百分比水平显著升高,心肌组织中Epac1、Rap1、CaMKⅡ蛋白表达显著上调,ERK1/2磷酸化水平降低。与I/R组比较,VT(3、6、12 mg/kg)预处理组可显著降低小鼠血清中LDH水平,抑制小鼠心肌组织中Epac1、Rap1与CaMKⅡ蛋白表达,促进ERK1/2磷酸化。病理组织学结果显示,I/R组小鼠心肌纤维排列紊乱、断裂,间隙增加,炎性细胞浸润明显;VT(3、6、12 mg/kg)预处理组小鼠心肌纤维排列较整齐,炎性细胞浸润较少。结论VT可能通过调节Epac1/CaMKⅡ信号通路,下调CaMKⅡ蛋白表达,促进ERK磷酸化,有效减轻MIRI。

RAP1A和EPAC1在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达及意义

目的检测RAS相关蛋白1(RAP1)的异构体RAP1A和环磷酸腺苷交换蛋白1(EPAC1)在卵巢子宫内膜异位症的表达和分布,探讨两者在疾病发生、发展中的作用及意义。方法收集2019年6月—2020年1月在中南大学湘雅医院妇科行腹腔镜下卵巢子宫内膜异位症手术患者的临床资料及组织,采用免疫组织化学法检测RAP1A和EPAC1在异位内膜、在位内膜、正常内膜的表达和分布情况,采用Western blotting法检测蛋白的表达,分析RAP1A和EPAC1表达的相关性。结果RAP1A表达于腺上皮细胞及间质细胞的细胞质,在在位内膜腺上皮细胞呈强阳性表达;EPAC1表达于腺上皮细胞的细胞质,在间质细胞的细胞质和细胞核都有表达,在腺上皮细胞的细胞质呈强阳性表达。2种蛋白在异位内膜、在位内膜及正常内膜的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中异位内膜、在位内膜的表达均高于正常内膜(P<0.05),异位内膜与在位内膜的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关性分析显示,RAP1A和EPAC1的表达水平在异位内膜(r=0.635,P<0.05)、在位内膜(r=0.697,P<0.05)和正常子宫内膜(r=0.436,P<0.05)均呈正相关。结论RAP1A和EPAC1在卵巢子宫内膜异位症中呈高表达,两者可能相互协同,促进异位病灶的发生、发展。

鲸类二次水生生境适应Epac1和Epac2基因的分子进化

心率即心脏跳动的速度,不仅反映心脏的功能,还与寿命的长短及能量代谢有关。与大多数陆生哺乳动物相比,鲸类心率显著降低。降低的心率有助于鲸类寿命的延长及能量的高效利用,便于其适应极端的海洋环境,而这一适应的分子机制尚不清楚。鉴于此,本研究采用基于最大似然法的枝模型、枝位点模型结合蛋白质功能差异分析等方法,对控制心率的环腺苷酸结合蛋白(Epac1和Epac2)基因进行适应性探究。分析结果表明,Epac1在长寿鲸类即须鲸类和抹香鲸(Physeter macrocephalus)组合进化支中检测到加速进化过程,且枝位点模型在须鲸类祖先支中检测到的强烈的正选择位点均位于功能重要的催化区;另外,该蛋白质在鲸类中还发生了显著的功能修饰(θ=0. 529 6±0. 130 0; P <0. 001)。对Epac2进行相同的分析发现,该基因在寿命长达200年之久的弓头鲸(Balaena mysticetus)中检测到的正选择位点同样位于功能重要的催化区。上述结果提示Epac1和Epac2在鲸类中均产生了适应性进化,这一方面可能有助于鲸类心率降低,另一方面也可能与其较长的寿命及高效的能量利用有关。

基于Epac1-MEK通路探讨黄芩苷对脊神经结扎模型大鼠的保护机制

目的基于Epac1-MEK通路探讨黄芩苷(BA)对脊神经结扎模型大鼠的保护机制。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BA低剂量组(15 mg/kg)、BA中剂量组(30 mg/kg)、BA高剂量组(60 mg/kg)、加巴喷丁(GAB)组(100 mg/kg),每组12只,除假手术组外,其余各组制备脊神经结扎(SNL)模型,分组处理后,分别采用机械性疼痛刺激试验、热敏试验、神经传导速率试验检测各组机械性痛觉过敏程度、热痛觉过敏程度、神经传导速度;以酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平;以Western印迹实验检测脊髓组织Epac1-MEK通路相关蛋白表达情况。结果与假手术组比较,模型组大鼠缩爪阈值、热敏潜伏期、神经传导速度显著降低(P<0.05),IL-6、TNF-α水平及Epac1、p-MEK蛋白表达显著增高(P<0.05),MEK蛋白表达无显著变化(P>0.05);与模型组比较,BA低剂量组、BA中剂量组、BA高剂量组及GAB组大鼠缩爪阈值、热敏潜伏期、神经传导速度升高(P<0.05),IL-6、TNF-α水平及Epac1、p-MEK蛋白表达降低,且BA各组之间呈剂量依赖性(P<0.05),MEK蛋白表达无显著变化(P>0.05);BA高剂量组与GAB组比较,上述各指标无显著差异(P>0.05)。结论BA可抑制SNL模型大鼠炎症反应,降低疼痛敏感程度,减轻改善其临床症状,可能是通过下调Epac1-MEK通路实现的。

丙泊酚通过调节脊柱GluN2B-p38MAPK/EPAC1通路减轻大鼠术后疼痛

目的探究丙泊酚减轻通过GluN2B-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/环磷酸腺苷(cAMP)结合蛋白(EPAC)1通路对大鼠术后疼痛的影响。方法将大鼠随机分为3组,空白组(未治疗,n=15)、异氟烷组(足底切口全麻,吸入2.5%异氟烷,n=15)、丙泊酚组〔接受足底切口全身麻醉,通过植入导管静脉输注丙泊酚至侧尾静脉,输注率为1.5 mg/(kg·min),n=15〕。建立大鼠足底切口痛模型。取脊髓背角(L3~L5),采用Western印迹和免疫荧光法检测GluN2B、p38MAPK、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、EPAC1表达水平。结果与异氟烷组相比,丙泊酚组机械性疼痛显著改善(P<0.05)。相对于空白组,异氟烷组合丙泊酚组的GluN2B-p38MAPK/EPAC1通路相关因子显著增强(均P<0.05)。但相对于异氟烷组,丙泊酚组的GluN2B-p38MAPK/EPAC1通路相关因子表达被显著抑制(均P<0.05)。相对于空白组,异氟烷组和丙泊酚组脊髓组织中c-Fos阳性细胞显著增加,相对于异氟烷组,丙泊酚组c-Fos阳性细胞数目显著减少(均P<0.05)。结论丙泊酚可有效改善动物术后疼痛反应,抑制脊髓GluN2B-p38MAPK/EPAC1信号通路和c-Fos的表达。

由cAMP激活的鸟苷酸交换蛋白(Epac1)调控内皮细胞表面膜联蛋白A2的表达

目的本研究旨在探讨内皮细胞内Epac1是否参与调控细胞表面膜联蛋白A2(ANXA2)的表达.方法以人静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型,采用原子动力学检测方法,结合免疫荧光,分别从原子及蛋白水平验证Epac1是否参与细胞表面ANXA2表达的调控作用.分别提取15只Epac1基因敲除小鼠和15只C57BL6野生型小鼠血浆,检测每组样品ANXA2的表达水平.结果①免疫荧光测得对照组(ESI09)相对荧光强度为17.59±0.69,处理组(ESI09)相对荧光强度为6.32±0.32,两组间数据结果有差异且有统计学意义(P<0.01);原子动力显微镜法测得处理组(ESI09)测得力值为(35113.07±9866.65)pN,对照组(DMSO)测得力值为(106277.70±14233.77)pN,两组间数据结果有差异且有统计学意义(P<0.01);由以上数据可知药物性抑制内皮细胞Epac的功能使其表面ANXA2表达量下调;②蛋白印迹法及酶联免疫吸附法测得处理组(ESI09)和对照组(DMSO)内皮细胞分泌ANXA2有差异,药物性抑制内皮细胞Epac1功能使内皮细胞胞外分泌ANXA2能力下降低;③酶联免疫吸附法测得Epac1基因敲除小鼠组血浆ANXA2平均含量为(138.81±38.93)ng/ml,显著低于野生型小鼠组血浆ANXA2平均含量(281.46±49.66)ng/ml(P<0.05).结论Epacl参与调控内皮细胞表面ANXA2的表达.

右美托咪定预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制

目的观察右美托咪定(Dex)预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的影响,并探讨其机制是否与氧化应激及Epac1/Rap1信号通路有关。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、Dex组、抑制剂组各8只。Dex组在建模前30 min腹腔注射Dex,抑制剂组在建模前30 min及25 min时分别腹腔注射Epac1拮抗剂ESI09及Dex,假手术组、模型组在建模前30 min腹腔注射相同剂量的生理盐水。除假手术组外,各组均通过结扎左冠状动脉建立MIRI模型,假手术组心脏仅穿线而不结扎左冠状动脉。采用苏木精—伊红(HE)染色观察各组心肌组织病理学变化,ELISA法检测大鼠血清心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)及氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),Western blotting法检测大鼠心肌组织Epac1/Rap1信号通路相关蛋白Epac1、Rap1。结果假手术组心肌纤维排列整齐、边缘清晰,未见心肌纤维断裂和细胞间质肿胀;模型组心肌纤维出现断裂,排列紊乱、边界模糊,有明显中性粒细胞浸润,细胞间质肿胀明显;Dex组与抑制剂组心肌纤维断裂、中性粒细胞浸润减少、间质肿胀均减轻。血清CK-MB、LDH模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组;血清MDA模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组,血清SOD假手术组>抑制剂组>Dex组>模型组;心肌组织Epac1、Rap1蛋白表达模型组>Dex组>抑制剂组>假手术组(P均<0.05)。结论Dex预处理对大鼠MIRI具有抑制作用,其机制可能与激活Epac1/Rap1信号通路减轻心肌组织氧化应激有关。

Epac与神经系统疾病的相关性研究进展

Epac是近年来新发现的分子,单独或与PKA联合接受cAMP的作用。Epac在体内广泛分布,也导致其功能的多样性。研究发现,Epac在精神分裂症、阿尔兹海默综合征、自闭症等神经系统疾病中扮演重要作用。本文从Epac的分布、结构和功能以及与神经系统疾病的相关性作一综述。

p120-连环蛋白对大鼠急性肝衰竭的保护作用

目的探讨p120-连环蛋白(p120cnt)表达对急性肝衰竭(ALF)内皮损伤和炎性激活的影响,分析p120cnt的抗炎效应是否可以通过对Epac1信号通路的调控来发挥作用。方法查询GenBank中大鼠p120cnt cDNA文库,设计引物,PCR扩增目的基因,琼脂糖电泳鉴定结果。经酶切、连接克隆至带绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体,转化E.Coli JM109并筛选阳性菌落,提取重组质粒后酶切,测序验证,确保表达框无误。选择健康雄性Wistar大鼠36只,按随机数字表法分为正常对照组、ALF模型组、质粒转染+ALF建模组,每组12只。脂多糖(LPS)联合D-GalN法构建ALF动物模型,使用裸质粒流体力学基因转染法转染大鼠,肝组织切片荧光显微镜观察转染是否成功。以上处理12h后处死大鼠取肝组织切片进行HE染色及TUNEL分析,评估各组肝细胞坏死程度;半定量RT-PCR评估各组肝组织p120cnt mRNA及Epac1mRNA表达水平。结果 PCR扩增目的基因,1.2%琼脂糖电泳显示目的基因约2800bp。真核表达重组体pCMV/p120ctn提取质粒后酶切,酶切产物基因测序显示质粒构建正确。基因转染后大鼠肝组织切片内可见大量GFP表达说明转染已成功。大鼠肝组织切片HE染色及TUNEL分析说明质粒转染+ALF建模组肝细胞坏死严重程度低于ALF模型组。大鼠肝组织p120cnt mRNA表达强弱顺序为:正常对照组>质粒转染+ALF建模组>ALF模型组(均P<0.01)。大鼠肝组织Epac1mRNA表达强弱顺序为:质粒转染+ALF建模组>ALF模型组>正常对照组(P<0.05或P<0.01)。结论 p120cnt存在对ALF的抗炎作用和肝保护作用;p120cnt对肝组织急性炎症的抑制效应与上调Epac1基因表达有关。