猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株epf基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Western blot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。

猪链球菌EPF基因PCR检测方法的建立

根据已发表的猪链球菌EPF基因序列,设计一对特异性引物,以猪链球菌DNA为模板,进行PCR扩增,标准菌株、疑似病例分离菌株在预计的729bp位置上扩增出特异性条带,表明这套引物成功扩增出目的基因序列,但副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论本研究建立的PCR方法可以用于猪链球菌的检测,为猪链球菌病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。

拟南芥EPF/EPFL基因对核盘菌抗性的功能分析

EPF/EPFL基因家族成员编码一类富含半胱氨酸的分泌型小肽,本研究通过实时荧光定量PCR检测、核盘菌接种和二氨基联苯胺(DAB)染色分析11个EPF/EPFL基因在拟南芥对核盘菌防御反应中的作用.荧光定量PCR分析显示,接种核盘菌后,EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表达水平至少在一个时间点明显上调.核盘菌接种处理后,epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9拟南芥单突变体叶片的病斑面积与野生型拟南芥(WT)相似,且DAB染色显示的HO含量也与WT没有明显的差别;epfl1,2,4,6四突变体拟南芥叶片的病斑面积明显大于WT.DAB染色结果显示,与WT相比,epfl1,2,4,6四突变体拟南芥的HO含量明显增多.荧光定量PCR结果进一步显示,与WT相比,核盘菌抗病相关基因YDDs在epfl1,2,4,6四突变体拟南芥接种核盘菌前后的表达量均明显下调.这说明EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在拟南芥应答核盘菌的防御反应过程中存在冗余功能,通过介导YDDs基因的表达,共同调控植物免疫反应.