长春地区幽门螺杆菌cagA基因及EPIYA基序多态性分析

目的 研究长春地区就医人群中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）毒力基因cagA携带率及其3′端编码CagA蛋白EPIYA基序多态性,并探讨其结构特征的差异与疾病的关系.方法PCR法扩增临床分离株Hp的cagA基因并测序,DNAMAN软件将测序后的核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用软件MEGA6.0对测序Hp的cagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列进行多重对比分析和构建系统发育进化树.结果 收集298例胃黏膜标本,共分离60株Hp菌株.Hp检出率与性别和年龄无关（P〉0.05）,消化性溃疡（PUD）组的Hp分离率高于非溃疡性消化不良（NUD）组（P〈0.05）.cagA基因阳性率为90%（54/60）.其中成功测序的26株中,23株为东亚型,占88.4%;3株为西方型,占11.6%.东亚型菌株中22株为EPIYA-ABD,1株为EPIYA-ABBD;西方型菌株中,2株为EPIYA-ABC,1株为EPIYA-BC.经构建进化树发现,序列聚类为东亚型群和西方型群两大类,在东亚型群中疾病分布并没有出现明显聚集,西方型群均来自PUD组.4株来自PUD组的Hp发生了氨基酸突变且均发生在EPIYA-B这个片段.结论 本地区分离的Hp cagA基因阳性率为90%,分布与胃肠疾病类型无关;EPIYA分型以毒力强的东亚型EPIYA-ABD 型为主（84.6%,22/26）.EPIYA-B片段氨基酸突变与消化性溃疡密切相关;cagA 3′端DNA序列变化不大,没有明显的地区聚集性.

重庆地区幽门螺杆菌的EPIYA基序多态性与胃十二指肠疾病的关系

目的：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）产生的细胞毒素相关蛋白A（cytotoxin associated antigen A,Cag A）羧基末端的EPIYA序列与胃十二指肠疾病的关系一直存在争议。本研究采集大量H.pylori高感染率同时也是胃癌高发病率的中国重庆地区的病例,通过检测患者感染的H.pylori Cag A羧基末端EPIYA基序的多态性,探讨EPIYA基序与临床胃十二指肠疾病发生的潜在关系。方法：收集消化不良患者的胃黏膜标本分离培养H.pylori,提取细菌基因组DNA,PCR扩增Cag A基因的3＇端区域并分型,根据分型结果随机抽样测序确认,结合分离出H.pylori患者的病历资料,分析EPIYA类型与胃十二指肠疾病之间的关系。结果：292（97.3%）株为Cag A阳性,但Cag A阳性与胃十二指肠疾病病型无关（P〉0.5）。19例（6.51%）为不同EPIYA类型菌株混合感染,胃癌病例中混合感染出现的概率明显高于NUD者（OR=4.46,95%CI=1.17~17.03）。单一菌株感染者273株（93.49%）,其中EPIYA-ABD型254株（93.04%）,EPIYA分型和胃十二指肠疾病的临床病型之间无显著性差异。另外,基因测序标本中发现8株EPIYA-B基序的核苷酸序列存在基因突变。结论：该研究中EPIYA-ABD型占H.pylori感染者的绝大多数,但Cag A阳性和EPIYA-ABD型均与H.pylori感染引起的胃十二指肠疾病无关;然而胃癌患者中混合感染出现的概率明显高于非溃疡性胃炎患者。

幽门螺杆菌毒素相关蛋白A的EPIYA多态性对胃上皮细胞AGS形态及IL-8表达的影响

目的:比较研究幽门螺杆菌毒素相关蛋白A(Cag A)不同分型对胃上皮细胞AGS形态及IL-8表达影响的差异。方法:设计、人工合成并优化不同cag A基因型,构建相应表达载体,转染胃上皮细胞AGS后观察不同型Cag A对细胞形态及IL-8表达的影响。结果:转染后每6 h进行细胞形态观察,于24、36 h对形成蜂鸟状细胞的数量进行统计分析,结果表明,各型Cag A均能引起发生蜂鸟状改变的细胞数量增加;较空载体对照,Cag A的6种型别皆有非常显著差异,Cag A ABCCC与其余5种Cag A型别有非常显著差异。同时于转染后12、36 h对细胞分泌的IL-8进行检测,统计分析表明,转染后12 h,转染各型Cag A细胞的IL-8表达量开始出现差异;转染后36 h,较空载体对照,Cag AABD、Cag A J-Western、Cag A ABDD和Cag A ABCCC存在非常显著差异,Cag A ABDD和Cag A ABCCC分别与Cag AABD、Cag A ABC存在非常显著差异。结论:幽门螺杆菌Cag A可引起转染后的AGS细胞发生蜂鸟状改变及IL-8表达增加,EPIYA基序C数目的增加与细胞蜂鸟状改变呈正相关,EPIYA基序C和D数目的增加与IL-8表达呈正相关。

不同地区幽门螺杆菌cagA基因羧基端可变区及其蛋白序列差异分析

目的:比较不同地区H pylori cagA 3'端可变区序列差异及序列的地域特征,分析差异与疾病的相关性.方法:选择本实验室所收集的20例cagA+的PCR产物进行测序,并通过ExPASy-Translation软件推测其氨基酸序列,搜索并收集GenBank中已公布的不同地区3-6个H pyloricagA 3'端可变区序列及其氨基酸序列进行比较分析.结果:cagA蛋白的氨基酸序列可分为具有明显地域特征的东亚型和西方型两类;部分东亚型菌株表现出西方型变异.87.4%的菌株具有3个串联排列的EPIYA基序,8.2%的菌株具有4个或以上EPIYA基序.新发现1条具有区域特征的含有3个氨基酸的序列.cagA蛋白氨基酸序列中的EPIYA数目与临床结果没有相关性.结论:H pylori cagA基因及其cagA蛋白序列具有明显多态性,可以根据H pylori cagA 3'端可变区的主要序列差异进行地域分型,cagA 3'端可变区的EPIYA基序的数目与临床结果没有相关性.

幽门螺杆菌临床株cagA基因克隆及序列分析

目的分离鉴定临床分离株幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp），分析其CagA蛋白的磷酸化基序EPIYA，探讨东亚株HpCagA序列的结构特点。方法选取胃相关疾病患者的胃黏膜组织，剪碎后接种于哥伦比亚血琼脂平板，微需氧培养，菌落生长后通过尿素酶试验、革兰染色及显微镜检查对Hp进行初步鉴定。提取菌落基因组，PCR扩增HP16SrRNA基因并进行测序鉴定；扩增cagA基因全长序列，连接入pMD18-T载体。将重组质粒转入感受态E．coliDH5a，测序鉴定重组质粒，利用DNAStar和MEGA6软件对cagA序列进行比对及聚类分析。结果成功分离Hp共26株。构建pMD18-T／cagA克隆载体后对26株Hp的cagA基因全长测序，序列比对分析显示有6株为西方型，20株为东亚型。东亚型CagA第815～834位点存在13个氨基酸的缺失、部分缺失或变异，西方型中有3株丢失磷酸化位点EPIYA-C；聚类分析显示Hp分离株分别聚类为东亚群、西方型东亚群以及西方群3群。结论Hp分离株以东亚株为主，但也存在西方株感染；东、西方型CagA在EPIYA基序及侧翼序列显著差异，菌株之间存在聚类关系。