花粉管通道法转EPSPS基因创制耐草甘膦玉米种质

【目的】对T_(0)-T_(3)代转基因植株进行抗草甘膦EPSPS基因的筛选检测,以期得到遗传稳定的转基因株系。【方法】利用花粉管通道法将EPSPS基因转入优良自交系京92中,通过田间草甘膦筛选和分子检测鉴定外源基因在世代间的遗传表达。【结果】在田间用200 mg·L^(-1)的草甘膦除草剂筛选,T_(0)代15个抗性植株经PCR鉴定,共获得10个阳性植株,转化率为1.03%;对各株系从T_(1)代到T_(3)代逐代筛选淘汰,株系内阳性株数逐渐增多,在T_(3)代5个株系中分离出K3和K8两个整合了EPSPS外源基因的稳定遗传株系;进一步对K3和K8两个株系的T_(3)代采用试纸条进行功能表达分析,发现目的基因均能正常表达。【结论】K3和K8两个转基因玉米株系后期可作为培育耐草甘膦的基础材料。

转EPSPS基因抗除草剂水稻恢复系的培育及育种评价

为了培育既抗除草剂、综合性状又优良的杂交水稻组合,将3份抗除草剂衍生恢复系(华84EP-1、2、3)与5份不育系(红香2A、Y58S、广占63-4S、华1015S、天源6S)配组,对亲本、杂交组合的除草剂抗性和10个主要农艺性状(单株产量、结实率、千粒重、生育期、株高、有效穗数、着力密度、穗总粒数、穗实粒数、穗长)的配合力效应进行了分析。结果表明,所选育的恢复系的除草剂抗性接近完全(>96%),利用苗期喷施农达可有效地提高杂交品种纯度;恢复系、不育系的一般配合力分别在5个性状(结实率、生育期等)、7个性状(结实率、千粒重等)上达到了显著差异;杂交组合的特殊配合力仅在生育期上达到了显著差异。杂交组合中比对照增产最高的分别是天源6S/华84EP-1、红香2A/华84EP-3和华1015S/华84EP-1。因此,利用抗除草剂恢复系配制水稻杂交组合不仅可以提高品种纯度,也可以培育出强优势组合。

杂草环境下转EPSPS基因大豆NZL06-698的生态适应性研究

为研究转EPSPS基因大豆NZL06-698在杂草环境中的生态适应性,试验设置杂草处理模拟野外环境,研究转基因大豆NZL06-698(GT698)的生存竞争能力以及外源EPSPS蛋白表达情况。结果表明:在相同处理下转基因大豆GT698的株高(R8期)、百粒重显著高于亲本大豆蒙豆12(MD12),但单株产量、单株籽粒数、结实率显著低于亲本大豆,说明外源基因的存在并未增强转基因大豆的生存竞争力,且转基因大豆在野外的生存竞争能力与亲本大豆相比较弱。试验注意到,杂草环境对转EPSPS基因大豆的生长有明显的限制作用,杂草处理下转基因大豆的单株产量、单株籽粒数、百粒重、结实率等指标均显著低于对照处理。ELISA检测结果表明,转基因大豆叶片及籽粒中外源EPSPS蛋白在杂草处理及对照中均正常表达,且两种处理下的EPSPS蛋白表达量无显著差异。以上结果表明杂草环境中转基因大豆的EPSPS蛋白正常表达,正常提供抗草甘膦性状,但是外源基因的存在并没有增加转基因大豆的生存竞争能力,且转基因大豆的生长受到杂草环境的显著抑制,由此得出结论:与亲本大豆相比,转EPSPS基因大豆NZL06-698在野外环境中生态适应能力较弱。

抗除草剂草甘膦EPSPs基因在小麦中的转化

通过基因枪法，用抗除草剂车甘膦的EPSPs基因转化小麦京花1号的幼穗约1000个，及幼胚约800个，经草甘膦选择后分别获得38株和4株再生植株。这些再生植株经PCR和（或）Southern杂交证明，其中有部分再生植株的基因组中稳定整合了外源EPSPs基因，并且转化体中部分是可育的。首次用实验证明，抗除草剂草甘膦的EPSPs基因作为单子叶禾谷类作物小麦基因转化的选择标记是行之有效的。

外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位

通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对转基因大豆中外源EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测,结果表明,EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中,而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移法获得了转基因大豆插入位点的侧翼序列,序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740,NOS下游的大豆DNA序列起始于Gm02:7777705。在本研究检测序列范围内发现插入位点两侧不同位置有3个不同的未知片段、2个大豆基因组序列倒位,同时发现2个大豆基因组片段丢失。外源基因不是以点插入方式整合,而是导致大豆基因组约135kb片段的移位;NOS下游大豆基因组序列发生重排,导致一个编码HEC1和HEATrepeat两个功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响,首次发现该基因在ABA和PEG处理时下调表达,推测该基因通过ABA信号通路参与胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析,明确了外源EPSPs基因在大豆基因组中的整合、定位及其侧翼序列,为转基因大豆安全评价提供了依据。

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。

抗除草剂bar基因与EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究

通过农杆菌介导法,分别将bar基因和EPSPS基因导入到甘蔗中,分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂,证明了转基因甘蔗T0、T1代、宿根1代和宿根2代外源基因遗传稳定,且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗,可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样,有广阔的应用前景。

陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。

转EPSPS基因抗草甘膦棉花的遗传分析

为分析转基因抗草甘膦棉花早代遗传情况,以花粉管通道法获得的26个转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)抗草甘膦棉花转化事件为材料,以其背景亲本中棉所49为对照,喷施草甘膦后对转基因棉T1、T2分离比例进行考察。T1田间抗性鉴定结果表明,经卡方检测20个转化事件T1分离符合3∶1的分离规律,即外源基因插入1个位点;6个转化事件不符合1对基因的分离规律,出现了偏分离。T2田间抗性鉴定结果表明,通过花粉通管法共获得152个纯合株系,分别来源于25个转化事件;对T2不纯合株系继续进行分离比例的考察,发现来源于15个转化事件的57个株系符合3∶1的分离规律;此外卡方检测结果表明,每个转化事件都有不符合3∶1分离规律的株系,且其中10个转化事件没有符合3∶1分离规律的株系。表明通过花粉管通道法获得的转基因植株中外源基因的整合和遗传均较复杂。

棉花品系Y18在草甘膦胁迫下的epsps基因表达分析研究

5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)是植物或微生物体内合成芳香族氨基酸所必需的一个关键酶,但其受广谱性除草剂草甘膦的强烈抑制。通过对草甘膦胁迫下的棉花品系Y18进行研究发现:棉花品系Y18具有两个不同的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps1和epsps2,并且两个基因的编码区与其他植物的epsps基因具有较高的同源性,在草甘膦胁迫作用下,棉花的epsps1基因中表达较为稳定,epsps2基因表达量却提高了1.85～2.3倍,初步认为epsps基因的表达量提高是生物在受到胁迫作用时的一种应激反应。

利用玉米茎尖技术转化TR1-EPSPS

茎尖转化法是目前发展较快的农杆菌转化技术。本研究利用茎尖转化法将载体pCambia-35S-TR1-EPSPS转入玉米的自交系中,通过草甘膦除草剂筛选得到46株抗除草剂的玉米幼苗,通过PCR验证,这些幼苗中有9株含有外源载体片段。

转基因玉米EPSPS蛋白适体的筛选与结构分析

通过体外合成长度为70个碱基的随机ssDNA文库,采用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以转基因玉米EPSPS蛋白为靶目标进行16轮筛选,将筛选到的适体群进行克隆、测序,初步获得与转基因玉米EPSPS蛋白特异性结合的适体。并用Macaw2.05和DNAMAN软件对每个适体的保守序列和二级结构进行分析。结果表明:一级结构分析序列同源性可分为四大群,其中A群有11条序列含有67个保守碱基;二级结构分析结果表明,茎环状和口袋状等结构可能是适体与转基因玉米EPSPS蛋白结合的结构基础。利用SELEX技术获得与转基因玉米EPSPS蛋白特异结合的适体群,其一级和二级结构与亲和力密切相关。

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。

大豆ms1轮回群体应用于转EPSPS基因大豆育种改良研究

针对抗草甘膦转EPSPS基因大豆遗传基础狭窄的问题,利用ms1轮回群体拓宽抗草甘膦转基因大豆的遗传基础。利用遗传基础丰富的ms1基础群体,与现有的抗草甘膦转EPSPS基因大豆新品系冀K32、冀K331、冀K69、冀K964建立抗草甘膦C0群体,C0群体改良后形成C1群体。分析基础、C0、C1 3个群体的品质、产量等农艺性状。结果表明,C1群体蛋白变化为35.66%~48.02%;脂肪变化为16.34%~22.92%;株高变化为46.00~158.00 cm;分枝数变化为0~8个;百粒质量变化为10.30~25.30 g;单株重变化为1.60~59.60 g。C1群体中不育株所占比例为19.20%,抗草甘膦性株所占比例为70.54%。利用大豆ms1基因构建了一个含EPSPS基因的转基因大豆轮回群体,该群体性状分离广泛,遗传多样性丰富,适合转基因大豆育种材料筛选。

芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

作者从芸苔(Brassicacampestris)中用RT PCR方法获得了EPSPs基因的cDNA 与其他物种中的EPSPs基因进行了比对和分析发现:芸苔EPSPs基因的cDNA与欧洲油菜的同源性最高,为93%,与水稻同源性最低,仅为64% 将芸苔EPSPs的ORF片段插入到GTK融合表达载体中。

EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.

转cry1Ab/vip3H+epsps基因粳稻对非靶标害虫稻叶蝉田间种群的影响

转基因作物可能带来的风险之一是对非靶标生物尤其是非靶标植食者产生潜在的影响。本研究采用吸虫器取样法,通过在浙江长兴2地点3年的试验评价了新型抗虫/耐除草剂转cry1Ab/vip3H+epsps基因粳稻(G6H1)及其亲本对照(秀水110,XS110)对稻叶蝉田间种群动态的影响。结果表明:叶蝉类主要有黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps(Uhler)、二点叶蝉Cicadula fascifrons(Stl)和电光叶蝉Deltocephalus dorsalis Motschulsky组成,其中黑尾叶蝉是优势种。虽然3种叶蝉的种群密度随着地点和年份的不同有所不同,但是转基因水稻对3种叶蝉种群密度的年度变化均没有显著性影响。少数年份,黑尾叶蝉成虫、若虫及其两者总密度的时间动态在转基因水稻和对照田之间存在差异,大多数年份,趋势一致且无显著差异(P>0.05)。另外,二点叶蝉和电光叶蝉种群的时间动态在转基因水稻和对照田之间也相似。综合评价认为,本供试转基因水稻品系G6H1对稻田稻叶蝉种群无明显的负面影响。

EPSPS外源基因对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响

以G6-1至G6-19等19个转基因抗草甘膦除草剂棉花种质为材料,以其非转基因背景亲本中棉所49为对照,研究EPSPS外源基因导入对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响,结果表明外源基因的导入对棉花纤维上半部平均长度、马克隆值、断裂伸长率和断裂比强度等品质性状有显著影响;对于棉花衣分和铃重等农艺性状亦有显著的影响,衣分变异范围为30.5%~42.7%,T1和T2相关性分析表明衣分的变异为可遗传性变异,铃重最高为6.5 g,最低为4.6 g,两者相差40%。因此,转基因棉花育种研究不仅要注重目标性状的转育,还要注重非目标性状的筛选。

田旋花EPSPS基因表达特征及草甘膦对其表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR测定了田旋花不同组织、不同叶龄的EPSPS基因mRNA的相对表达量以及草甘膦对EPSPS基因相对表达量的影响。结果表明:田旋花EPSPS基因在不同组织表达量差异显著,在叶的表达量高于茎和根;该基因在9叶期的表达量最高,是3叶期的1.5倍;在草甘膦处理后,田旋花EPSPS基因的表达量先升高后降低,在处理后24h达最大值。随草甘膦剂量增加,该基因的表达量升高。研究结果可为深入解析田旋花对草甘膦耐药性机理提供参考。