比格犬ERβ_(1293)基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的观察比格犬Myc标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。

比格犬ERβ_(1293)稳定细胞系的建立

为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。