人组织era基因mRNA的表达谱

目的 研究人 era基因 m RNA在不同组织、不同细胞系的表达水平 .方法 用 α([32 p]d CTP标记人 era编码区基因作为探针 ,分别用 Northern杂交和斑点杂交分析含 12种不同成人组织 m RNA的 Multiple tissue northern(MTN)blot膜和含 76种成人、胎儿及常用细胞系 m RNA的 Multipletissue expression (MTE) array膜 ,并用同位素扫描系统对杂交结果进行图像分析 .结果 Northern blot杂交所检测的 12种组织中均有位于 2 .2 kb处的杂交条带 ,斑点杂交显示人era m RNA在所检测的 76种组织中均有表达 ,但表达水平有很大差异 ,在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达 .结论 人 era m RNA表达于所有检测的组织或细胞系 ,可能为一种组成性表达的基因 .

人era基因的克隆测序及表达

目的 克隆人的 era基因 (简称 Hera)并利用大肠杆菌进行表达 .方法 PCR扩增 Hera基因 ,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体 p GEX- 4T3,受控于 Ptac启动子 ,重组质粒 p GEX- Hera以大肠杆菌 DH5α为宿主菌 ,用 IPTG进行诱导表达 .结果 克隆了 Hera基因 ,测序正确 ;含重组质粒p GEX- Hera的菌体诱导后在 SDS- PAGE上出现一条新生蛋白带 ,相对分子质量为 6 5 ku,占菌体总蛋白的 2 3% .结论 成功扩增、克隆 Hera基因 。

利用基因芯片分析人era基因表达降低后细胞周期蛋白表达的变化

为了探讨利用RNAi封闭肿瘤细胞系的era基因表达后细胞周期相关蛋白的变化,实验利用Trizol法提取总RNA,用人细胞周期相关基因cDNA芯片检测细胞周期相关蛋白的表达。生物信息学分析结果显示:封闭肿瘤细胞系的era基因表达后,有10条细胞周期相关基因表达上调,7条基因表达下调,为研究人era基因的功能提供了线索。

era基因的高表达

为了高表达产生Era蛋白,借助计算机从Gene Bank中寻找N端几个氨基酸序列与Era相同的蛋白质,选其中能在大肠杆菌内高表达的λ Ea8.5蛋白,以其基因5’端序列替代天然era基因5’端序列,从而赋予era基因转录物以强的翻译起始信号,而不改变其编码的氨基酸序列。将此重组era基因置于P_L启动子下游、构建得质粒pCE31,引入大肠杆菌TAP106,经诱导后大量合成Era蛋白,且其他蛋白质的合成显著被抑制,从而使Era的含量能超过菌体总蛋白量的80%。经简单裂菌、洗涤步骤,就获得具有能特异结合鸟苷酸活性的、电泳单带纯的Era蛋白。

Dig标记Era用于相应结合蛋白基因的钓取

Era是大肠杆菌生存繁殖必需的era基因产物,属G蛋白。作者推测它与其它G蛋白一样,有相应的结合蛋白存在。为了寻找Era结合蛋白及其基因。

人类新基因era基因组织分布的免疫组织化学研究

目的：为了研究人ｅｒａ基因这一人类新基因表达产物的组织分布情况．方法：根据人ｅｒａ序列设计并合成扩增引物，用ＰＣＲ法从ｐＵＣ１９－ｈｅｒａ质粒中扩增人ｅｒａ基因（ｈ－ｅｒａ）全长ｃＤＮＡ和ｈ－ＥＲＡＣ端的结构域基因，并分别克隆到（Ｈｉｓ）６融合表达载体ｐＲＳＥＴ－Ｃ和非融合表达载体ｐＤＨ中，诱导表达（ＨＩＳ）６－ｈ－ＥＲＡ 融合蛋白和 ｈ－ＥＲＡＣ端结构域蛋白．用 ｈ－ＥＲＡＣ端结构域蛋白免疫新西兰白兔，制备兔抗 ｈ－ＥＲＡ抗血清．用 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ对兔抗ｈ－ＥＲＡ 抗血清．进行了鉴定，并成功地制备了兔抗ｈ－ＥＲＡ血清．利用在大肠杆菌中高表达、纯化的（Ｈｉｓ）６－ｈ－ＥＲＡ融合蛋白，对已制备的兔抗人 ＥＲＡ抗血清进行进一步鉴定纯化获得抗 ｈ－ＥＲＡ的特异性多抗；再对 ４月～５月人胎儿心、肝、肺、脾、肾等脏器和胃、小肠、睾丸、胸腺、胰脏及胆囊进行免疫组织化学染色．结果：在人类４月～５个月胎儿心、肝、肺、脾、肾脏等脏器和胃、小肠、睾丸中均有免疫反应阳性产物出现．胰脏、心、肺脏等是高表达，脾脏、胃、小肠是中等表达，睾丸、肝脏、肾脏呈低表达，胆囊、胸腺无免疫阳性表达产物出现．结论：人 ＥＲＡ在人类正常胎儿不同组织中?

金属硫蛋白-1与p53基因在燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞中的表达

目的观察金属硫蛋白-1(MT-1)、p53基因、雌激素受体(ERa)基因和甲胎蛋白(AFP)基因在燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞中的表达。方法收集贵州省兴仁县燃煤型砷中毒患者及非病区正常人口腔黏膜脱落细胞,提取mRNA,以荧光实时定量PCR(RT-PCR)方法检测与肝硬化及皮肤癌相关的MT-1及p53基因等表达。结果燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞MT-1基因表达与对照组比较明显减少(0.83±0.15、3.86±0.37),抑癌基因p53明显增加(4.35±2.79、0.90±0.58),ERa基因和AFP基因无变化。结论砷中毒患者口腔黏膜MT-1基因表达减少,抑癌基因p53表达增加,可作为燃煤型砷中毒患者皮肤及肝脏病变监测的敏感指标之一,RT-PCR技术可广泛用于砷中毒的防治、监测和科研。

兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBPhEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBPhEra偶联于NHSactivatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBPhEra,相对分子质量Mr为78×103,其纯度为95%。②从抗血清中纯化获得可与MBPhEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人的 era基因 (简称 hera)进行表达、纯化 .方法 PCR扩增 hera基因 ,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体 p RSET- C,重组质粒 p RSETC-hera以大肠杆菌 BL2 1(DE3)为宿主菌 ,用 IPTG进行诱导表达 .然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化 .结果 克隆了 hera基因 ,测序正确 ;利用 p RSET- C载体在大肠杆菌中融合表达了全长 hera- c DNA基因 ,表达量占细菌总蛋白的 5 9.6 % .融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在 ,在变性条件下用 Ni- NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白 ,其纯度达到了 98.0 % .结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了 hera基因 .

不同选择剪接形式的小鼠Era在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础。方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Westernblot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性。结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Westernblot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测。结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础。

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。

人era的结构特点分析及其定点突变体的构建

目的 构建最近克隆的人era基因的定点突变体。方法 利用数据库对era的结构特点进行分析 ,在此基础上用改良的重叠延伸法分别构建人EraN端和C端的定点突变体。结果 获得了分别针对人EraN端TGP结合结构域 (位于2 9 - 36氨基酸残基 )和C端具有RNA结合活性的KH结构域 (位于 2 97- 340氨基酸残基 )的定点突变体。

不同剪切形式的小鼠Era对L-929细胞的影响

目的: 构建两种完全可调控诱导不同剪接形式小鼠era的真核表达载体,检测不同剪接形式的鼠Era蛋白对细胞生长状态的影响.方法: 构建两种不同剪接形式鼠era的完全可调控诱导表达载体,分别与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞系L 929.用PonA进行诱导表达后,以West ernBlotting检测Era蛋白表达水平,以MTT法测定细胞生长曲线,以流式细胞仪检测细胞周期.结果: 成功获得稳定的可完全诱导表达两种不同剪接形式鼠Era蛋白的细胞系;经过PonA诱导后,过表达两种剪接形式Era蛋白的L 929细胞,生长速度加快,G2 /M期细胞数量明显减少.结论: 两种剪接形式鼠Era蛋白在真核细胞周期中发挥重要作用.

成纤维细胞中hEra-EGFP融合蛋白的表达定位

目的 研究人 era基因在体外培养细胞中的定位 .方法 将人 era基因克隆入带绿色荧光蛋白 (EGFP)荧光标签的真核表达载体 p SMEGFP,使其位于 EGFP的 N端 ,转染NIH3T3细胞 ,于转染后 2 4和 36 h分别用荧光显微镜观察 .结果 成功构建了 EGFP- h Era融合蛋白的表达载体 ,转染细胞后可见融合蛋白位于细胞的胞质近核膜处 .结论 用EGFP融合蛋白的方法初步将 h

过表达小鼠ERA蛋白对细胞系的影响

为了研究鼠ERA蛋白对细胞生长状态的影响,构建了可调控诱导表达载体pEGSH-mera,并与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞L-929。应用PonA进行诱导表达后,Western Blot检测其表达水平发现,细胞中鼠ERA蛋白明显增多;用MTT法测定其生长曲线发现,细胞生长加快;应用流式细胞仪检测其细胞周期发现,G2/M期细胞数量明显减少。所以,鼠ERA蛋白在细胞周期中发挥重要作用。

不同剪接形式鼠era在细胞内的定位

为分析两种剪接形式鼠era在细胞内的定位,构建了era-EGFP融合表达载体pSMEGFP-meraW和pSMEGFP-meraS,然后用其转染鼠细胞系NIH3T3。荧光显微镜观察发现,两种剪接形式鼠era-EGFP融合蛋白均定位于细胞浆中的核周围。同时,应用免疫荧光细胞化学法分析了自然情况下,鼠细胞系野生型era蛋白在细胞内的分布,结果显示细胞核与细胞浆中均有分布。推测鼠era蛋白在细胞浆中合成修饰后,才转移至细胞核发挥作用。由于era-EGFP融合蛋白难以进入核内或需要较长时间,所以导致era-EGFP与野生型鼠era在细胞内定位不尽相同。

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的 :对小鼠ERA蛋白 (mERA)进行表达、纯化 ,为真核生物ERA功能研究奠定基础 .方法 :构建MBP mER A融合表达载体 .在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白 ,经直链淀粉亲和层析纯化 ,WesternBlotting鉴定所表达纯化的蛋白 .结果 :表达的MBP mERA融合蛋白占菌体总蛋白的 1 8% ;纯化后的融合蛋白纯度为 70 % ;WesternBlotting证实了mERA蛋白的表达 .结论 :利用基因重组技术 ,在大肠杆菌中高表达了mera基因 ,并对融合蛋白进行了初步纯化 .

染色体12q15-q23中间缺失和周边角膜异常患者的临床和分子特征

PURPOSE: To describe the ocular features of a patient with an interstitial deletion of chromosome 12 and to determine the molecular boundaries of the deletion. DESIGN: Observational case report and laboratory investigation. METHODS: A patient with an interstitial deletion of chromosome 12 was clinically examined for ocular abnormalities. DNA samples were used for molecular studies to define the deletion boundaries. RESULTS: Ocular examination showed abnormalities of the anterior segment consistent with a diagnosis of cornea plana. Molecular analyses showed the deletion included the KERA gene,the SLRP (small leucine repeat protein) gene cluster,the genetic loci for autosomal-dominant (CNA1) and autosomalrecessive (CNA2) cornea plana,and a portion of the mapped locus for high myopia (MYP3). CONCLUSIONS: These results,combined with previous genetic linkage studies,identifies a 3-cM region located between microsatellite markers D12S82 and D12S351 that is likely to contain a gene responsible for CNA1.

ERas基因在胃癌中的表达及其作用机制的研究进展

胚胎干细胞(ES cells)为多能干细胞,来自哺乳动物胚胎早期。ES细胞表达的Ras(ERas)基因促进其体外增殖和肿瘤形成。该基因产物Ras蛋白关联和激活多个下游效应,调控多种细胞反应来参与细胞增殖,存活与分化。ERas基因位于X染色体短臂(Xp11.23),其cDNA编码的蛋白包含227个氨基酸,与传统ras基因Hras,Kras和Nras分别有43%,46%和47%的相似性,故属于新的ras家族成员,与传统ras基因不同的是ERas基因非常活跃但不带有任何突变。近几年发现ERas基因的表达与胃癌密切相关,本文就ERas基因在人胃癌细胞和组织中的表达及其机制的最新进展做一综述,主要包括三个方面:1,ERas基因在胃癌细胞和组织中的表达情况及其功能。2,ERas基因在胃癌细胞中的表观遗传调控。3,ERas基因与胃癌肝和淋巴结转移的关系。