小麦ERF转录因子W17互作蛋白的筛选和解析

来自小麦的ERF转录因子W17基因参与胁迫应答,过表达W17可显著提高转基因拟南芥的抗旱性和抗病性。本研究构建了小麦cDNA文库,通过酵母双杂技术筛选W17的互作蛋白,进一步解析ERF蛋白的作用机制。将pGBKT7-W17质粒、pGADT7和小麦文库混合转入酵母细胞AH109,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型平板上培养,挑选直径大于2mm的克隆,在SD/Raf/Gal/X-gal平板上划线培养,筛选蓝色克隆。将筛出的克隆测序、BLAST分析,得到4类与W17相互作用的候选蛋白,分别是胁迫相关功能蛋白、翻译后修饰蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基/小亚基以及功能未知蛋白。互作验证表明,HSP90和PPR蛋白与W17有相互作用关系。这些候选蛋白参与信号转导或免疫过程,暗示W17在植物的逆境信号转导、下游基因转录调控,甚至在翻译过程都有重要作用。

AP2/ERF蛋白调控植物的非生物胁迫应答机制

AP2/ERF蛋白是植物所特有的转录因子,参与植物生长发育以及调控生物和非生物胁迫反应。研究表明,AP2/ERF蛋白不仅与其它类型转录因子共同形成复杂的转录调控网络,通过多种信号转导途径调控功能基因的表达,而且可以作为外界信号的感应因子调控植物的非生物胁迫应答。主要从AP2/ERF蛋白在植物激素合成、蜡质合成、低氧胁迫应答、ROS清除以及蛋白质修饰等方面综述了AP2/ERF蛋白在植物非生物胁迫应答中的研究进展,并展望了今后的研究方向。

病原诱导的小麦ERF转录因子TaERF1b的原核表达及纯化

为了得到纯化的TaERF1b活性蛋白,将TaERF1 b基因含有AP2/ERF结构域的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中,构建GST-TaERF1b融合蛋白表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。0.1mmol/L IPTG即能诱导融合蛋白表达,37℃诱导4h或30℃诱导8h,融合蛋白均以包涵体的形式表达,16℃诱导12h,融合蛋白不表达。包涵体经溶解及稀释复性后,过GST亲和层析柱,获得纯化的融合蛋白,考马斯亮蓝法测得纯化蛋白的浓度约为0.5μg/μl,凝胶阻滞实验表明包涵体复性成功,所得蛋白具有生物活性。

番茄2个ERF-B1亚族转录因子基因的克隆及其对生物和非生物胁迫响应

为进一步研究番茄ERF转录因子调控植物抗逆的分子机理,本研究以番茄浙杂-301为试验材料,分别克隆获得2个乙烯反应元件结合蛋白基因SlERF83和SlERF109,并对其进行序列及表达分析。结果表明,番茄SlERF83和SlERF109基因分别含有678 bp和669 bp的开放阅读框,编码225和222个氨基酸,各含有1个保守的AP2结构域,属于亲水性蛋白。进化分析表明,这2个ERF转录因子均属于AP2/ERF家族中ERF亚族的B1组。SlERF83和SlERF109三级结构都含有1个α-螺旋和3个β-折叠。酵母单杂交及β-半乳糖苷酶活性测定结果证明SlERF83转录因子可以与GCC-box结合。番茄2个ERF蛋白启动子含有多种逆境相关的顺式作用元件。采用荧光定量PCR检测SlERF83和SlERF109在非生物和生物胁迫下的表达,结果表明,高盐和干旱胁迫下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制;水杨酸处理能够诱导SlERF83和SlERF109基因的表达;茉莉酸甲酯处理下SlERF83表达水平提高,SlERF109表达量降低;番茄黄化曲叶病毒侵染下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制。SlERF83和SlERF109转录因子可能参与了番茄对生物及非生物胁迫的响应过程。本研究结果为进一步深入开展ERF转录因子调控番茄抗逆分子机制研究提供了一定的理论依据。

木榄ERF转录因子基因的克隆及功能分析初探

利用RACE-PCR技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为BgERF(GenBank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREBP结构域,且编码的由475个氨基酸组成的蛋白具有典型的1个α螺旋,3个β转角的三维结构,在AP2/EREBP结构域的第14位为丙氨酸(A),第19位为天冬氨酸(D),属于AP2/EREBPF蛋白家族中的ERF类转录因子;NCBI-BLAST比对结果表明:该基因与胡萝卜、拟南芥、水稻、辣椒、番茄、大豆、马铃薯、陆地棉等植物ERF类转录因子具有较高的同源性;并构建了高效植物表达载体PBI121-35s-BgERF,获得的转基因烟草与野生型相比,表现出明显的耐盐性,为该基因功能的深入分析和耐盐机理的研究奠定了基础。

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,然后与CsAP2-09超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行SDS-PAGE验证,最后进行LC–MS/MS鉴定。得到17个互作蛋白,将蛋白进行注释、GO分析、KEGG分析,发现其中5个可能与植物抗病相关(如过氧化氢酶Cs3g27280)。构建这17个蛋白的互作网络,其中14个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对CsAP2-09与互作蛋白的共表达分析发现CsAP2-09超表达引起了16个蛋白表达上调和1个蛋白表达下调。