扩展青霉erg4的生物信息学、亚细胞定位及表达分析

麦角甾醇是真菌细胞质膜的特有组分,在真菌生长发育中具有重要作用。erg4是参与麦角甾醇生物合成最后一步反应的基因,但扩展青霉中该基因的功能未知。本文通过RT-PCR方法克隆了扩展青霉3个erg4(erg4A、erg4B和erg4C)基因的CDS全长,对基因结构、编码蛋白的跨膜螺旋和亲疏水性进行了生物信息学分析,通过融合绿色荧光蛋白定位的方法进行了亚细胞定位,测定了3个基因在不同生长发育阶段、不同培养基状态以及黑暗和蓝光条件下的表达差异。扩展青霉erg4A、eerg4B和erg4C的CDS全长分别为1476 bp、1491 bp和1596 bp,分别编码491、496和531个氨基酸;编码蛋白均属于跨膜蛋白,且表现出疏水性。绿色荧光蛋白与内质网红色荧光探针染色共定位结果显示,Erg4A、Erg4B和Erg4C均定位于内质网。erg4A、erg4B和erg4C在孢子阶段、孢子萌发阶段及成熟菌丝阶段的表达水平存在显著差异,其中,erg4A在3个阶段的表达量无明显变化,而erg4B和erg4C的表达量均显著上调,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4A在CY液体和固体培养条件下的表达量无显著变化,erg4B和erg4C在CY液体培养条件下的表达量显著高于固体培养,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4A和erg4B在蓝光条件下的表达量显著高于黑暗条件,以erg4B的上调幅度最为明显。erg4C对蓝光条件不敏感。扩展青霉Erg4A、Erg4B和Erg4C均定位于内质网,erg4A、erg4B和erg4C在不同生长发育阶段、固体和液体以及黑暗与蓝光培养条件下的表达存在较大差异,其中,以erg4B的响应最为活跃。

临床分离白念珠菌 ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系

目的：探讨临床分离白念珠菌 ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系。方法 M27-A2微量肉汤稀释法对34株临床分离白念珠菌菌株进行体外药物敏感性试验。抽提白念珠菌 ERG4基因的总RNA，并逆转录合成 cDNA，采用实时荧光定量 PCR（FQ-RT-PCR）方法检测 ERG4基因 mRNA 表达水平。结果白念珠菌耐氟康唑菌株组 ERG4基因表达量（4.20±2.56）高于敏感组（1.72±1.33）（t =3.99，P 〈0.05）；耐伊曲康唑组（3.60±2.47）高于敏感组（1.66±1.61）（t =3.71，P 〈0.05）；耐伏立康唑组（3.99±2.72）高于敏感组（2.07±1.58）（t =2.91，P 〈0.05）；对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药菌株组（4.49±2.73）显著高于敏感组（1.69±1.82）（t =3.81，P 〈0.05）。结论临床分离白念珠菌耐药菌株 ERG4基因高表达与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药及交叉耐药有关，但白念珠菌 ERG4基因高表达在耐药中的作用还有待于通过基因下调进一步研究证实。