基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响

目的:基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响。方法:从36只SD大鼠中随机选取6只作为对照组,其余大鼠给予高脂饲料联合1%链脲佐菌素(30 mg·kg^(-1))建立糖尿病模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄连解毒汤高剂量组(6.25 g·kg^(-1))、黄连解毒汤中剂量组(3.13 g·kg^(-1))、黄连解毒汤低剂量组(1.56 g·kg^(-1))及二甲双胍组(100 mg·kg^(-1)),每组各6只。各药物组按照相应剂量灌胃给药,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续21 d。第7天、第14天及第21天灌胃后,收集大鼠粪便,提取肠道菌群DNA。利用ERIC-PCR技术和Sanger测序检测大鼠肠道菌群结构与DNA同源性。结果:灌胃第7天,对照组条带较多集中在100~750 bp;与对照组比较,模型组条带在1 000~2 000 bp的亮度增强,在300~750 bp的亮度减弱;与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在750 bp的亮度增强。灌胃第14天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在1 000 bp以上的亮度减弱。灌胃第21天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在300~750 bp的亮度增强。DNA测序结果显示,灌胃第21天,对照组500 bp条带的优势菌群为拟杆菌属、杜氏邓氏菌和金黄杆菌属;模型组400 bp和1 000 bp条带的优势菌群为梭菌目细菌、普拉梭菌、铜绿假单胞菌和杆菌属。灌胃第7天,黄连解毒汤高剂量组750 bp条带的优势菌群为布劳特菌和拟杆菌属;黄连解毒汤中剂量组200 bp条带的优势菌群为脆弱拟杆菌和拟杆菌属;黄连解毒汤低剂量组1 200 bp条带的优势菌群为双发酵副梭菌;二甲双胍组1 000 bp条带的优势菌群为大肠埃希杆菌。灌胃第14天,黄连解毒汤高剂量组700 bp条带的优势菌群为拟杆菌目细菌和假单胞菌;黄连解毒汤中剂量组550 bp条带的优势菌群为假锁杆菌属和链霉菌属;黄连解毒汤低剂量组350 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、杜氏邓氏菌和杆菌科细菌;二甲双胍组290 bp条带的优势菌群为弗格森埃希菌和大肠埃希杆菌。灌胃第21天,黄连解毒汤高剂量组1 000 bp条带的优势菌群为普雷沃氏菌属;黄连解毒汤中剂量组600 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、杜氏邓氏菌和拟杆菌属;二甲双胍组400 bp条带的优势菌属为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、普雷沃氏菌属、杆菌科细菌和杆菌属。结论:黄连解毒汤对T2DM大鼠的肠道菌群结构具有调节作用,菌群调节效果受药物剂量和治疗时间的影响。

ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构

目的 了解大熊猫肠道微生物区系结构的相似性和稳定性,并找出大熊猫肠道微生物群落结构的变化与健康状况的关系。方法 对上海动物园及上海野生动物园所饲养的3只大熊猫2次采集的粪便样品进行微生物群落总DNA的抽提,并以此为模板获得反映肠道微生物群落结构特征的ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱,比较各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果 除国庆(大熊猫)的第1次采集的样品(当时处于腹泻状态) ,其他各DNA样品的ERIC- PCR及Southern杂交指纹图谱的相似性都达到85 %～10 0 % ;佳斯及川川(大熊猫) 2个个体2次采集的样品之间ERIC指纹图谱的相似性分别为93%和87% ,而国庆腹泻时的样品与健康时的样品之间则为71%。结论 大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比较相似,而且同一个体在不同时期表现出比较高的稳定性,但当个体的健康出现问题时肠道优势菌菌群结构有一定波动。所采用的DNA提取方法、ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱的高度重复性证明了之一分子生态学技术在大熊猫肠道微生物区系动态监测中的可行性。

基于rDNA ITS序列和ERIC-PCR研究虫草真菌无性分离物的遗传多样性

以24株虫草无性分离物和1个蛹虫草子实体为材料,利用ITS序列分析和ERIC-PCR方法对这些材料进行了遗传多样性分析。结果表明:ITS序列分析表明蝉花的无性分离物4645(菌生轮枝菌Lecanicillium fungicola)与蝉花的无性分离物4644和4646及蛹虫草的无性分离物亲缘关系较近,而冬虫夏草无性分离物4634及4636则为膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum;蛹虫草Cordyceps militaris无性型与蝉花Cordyceps cicadae无性型(4644、4646)及无性分离物4645聚成一族,而冬虫夏草分离物4634及4636与冬虫夏草的关系较近,聚成另一族。ERIC-PCR分析结果表明,在相似性系数为0.76时,上述分离物分成4组,即1)L.fungicola;2)T.inflatum;3)C.cicadae;4)C.militaris。上述结果表明虫草无性分离物具有丰富的遗传多样性。同时,本研究检测了上述无性分离物胞外液中虫草素的含量,发现所有蛹虫草无性分离物(除1811之外)的胞外液中均含有虫草素,但蝉花和冬虫夏草的无性分离物(4634、4636、4644、4645和4646)胞外液中的虫草素产量极低,甚至无法检测出。

腹泻儿童肠道菌群结构特征的ERIC-PCR指纹图分析

目的 :了解以粪检有无白细胞区分的两类腹泻儿童肠道菌群结构的特征及其与健康儿童的差别。方法 :提取健康儿童 (H)、临床门诊粪检无白细胞的腹泻儿童 (L )和粪检有白细胞的腹泻儿童 (L +)(各 11例 )粪便总DNA作模板 ,获得反映肠道菌群组成特征的ERIC PCR指纹图谱。结果 :以H、L 和L +为序 ,每类样品以独特的ERIC条带为代表的操作分类单元 (OTU)的总数分别为 5 4∶4 7∶2 6 ;每类样品ER IC图谱多样性指数范围分别为 :2 4 5± 0 14 ,2 11± 0 18和 1 76± 0 19。组内成对相似性系数累积曲线分析 :小于 0 6的CS 值在L 组占到总Cs值个数的 70 % ,在H组占 5 0 % ,而在L +组只占 30 %。结论 :腹泻儿童肠道的菌群结构多样性降低 ,粪检有白细胞腹泻个体较之粪检无白细胞腹泻个体肠道菌群结构偏离健康个体更远。

利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性

本文旨在采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。选用15羽28日龄肉鸡,按2mL/kgBW喂服枯草芽孢杆菌悬液(109CFU/mL),每天2次,连续3d,34日龄时,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法分析肠道菌群的多样性,并对DGGE条带进行回收、测序。结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P<0.05或P<0.01),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为53.2%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;回收条带以乳杆菌属细菌为主。结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PCR-DGGE检测方法明显优于ERIC-PCR。

ERIC-PCR:一种快速鉴别环境细菌菌株的方法

以 Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ（ 肠杆菌基因间共有重多序列） 序列设计的特异引物对３ 株大肠杆菌、３ 株软腐欧氏杆菌、２ 株草生欧氏杆菌、１ 株梨火疫欧氏杆菌、１ 株催娩克氏菌、１ 株阴沟肠杆菌和９ 株具有降酚能力的细菌等２０ 种细菌的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 分析．每种菌株均存在数目不等的各自独特的带型，能够区分同一种类中极为相近的菌株．经多次重复，各特异性扩增的主要带型能重复稳定出现．聚类分析的结果表明，供试菌株多数按照分类地位归到相应的组中．９ 种具有降酚能力的细菌中，２ 种分离自处理焦化废水池活性污泥，７ 种来自土壤样品． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 指纹图显示，前２ 种属于一类，都有一条大小约１ ．１ ｋｂ 的主带，其它７ 种土壤中分离出来的细菌除其中１ 种有１ 条约１ ．２ ｋｂ 大小的主带外，其余６ 种都有１ 条大小约１ ．４ ｋｂ 的带．聚类分析将从土壤中分离出来的细菌归为３ 种不同的类型． Ｅ Ｒ Ｉ Ｃ Ｐ Ｃ Ｒ 可以从分子水平对细菌基因组进行快速指纹图分析。

番茄内生菌分离及其ERIC-PCR指纹图谱分析

介绍了一种分离植物内生菌和研究其多样性的方法。用无菌水、化学试剂、紫外线和机械去表皮 4种方法对番茄植株进行处理 ,然后分别用牛肉膏蛋白胨、高氏一号和PDA(加链霉素抑制细菌生长 ) 3种培养基分离内生菌。确定了最适宜的去除非内生菌的方法。经分离、纯化得到 1 4 8株大小、形态、颜色各异的内生菌分离物。对其中 43株进行ERIC PCR扩增 ,32株有扩增条带的菌株可分为 2 8种。把纯化的菌株分别与番茄早疫病菌进行平板对峙培养。筛选出抑菌效果较好的

18株铜绿假单胞菌的耐药谱和ERIC-PCR分型

目的研究产金属β-内酰胺酶(MBL)的铜绿假单胞菌感染的菌株同源性和耐药谱。方法用纸片协同法筛选出产MBL铜绿假单胞菌株;琼脂扩散法检测MBL阳性株对10种抗菌药物的药敏结果;用肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法确定菌株之间的同源性。结果纸片协同法试验检测到18株MBL阳性菌株,它们对头孢噻肟、头孢曲松、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶完全耐药,对10种抗菌药物呈现7种耐药模式;ERIC-PCR结果显示,18株MBL阳性株呈现4种基因型,15株为同一基因型。结论该院ICU内产MBL铜绿假单胞菌在2005年第二季度出现暴发流行。

山东地区屠宰场猪肉污染沙门氏菌菌株毒力基因筛查与ERIC-PCR分型

目的了解生猪屠宰加工过程中沙门氏菌的污染状况、分离菌株的毒力基因携带情况及其溯源性追踪。方法应用液相芯片法对分离沙门氏菌进行血清分型,并对分离菌株进行毒力基因筛查,通过基因间重复序列为引物的聚合酶链式反应(ERIC—PCR)分型技术对代表性沙门氏菌分离株进行基因分型,并用NTSYS-pc2.10软件进行聚类分析。结果 1 480份样品共得到298株沙门氏菌菌株,分离率为20.14%;98.32%的分离菌株携带肠毒素stn基因;96%以上的分离菌株携带毒力岛SPI1、SPI5核心蛋白基因mogA、araB以及菌毛基因;选择实验的沙门氏菌遗传相似性在70%~100%之间,共分为9个基因型。结论山东地区屠宰环节猪肉中分离沙门氏菌携带多种耐药基因和毒力基因,德尔卑、鼠伤寒沙门氏菌占试验菌株的45.97%。

ERIC-PCR技术对单增李斯特菌的溯源分析

以质控菌株ATCC 19115为对照,采用ERIC-PCR方法对从三个市场猪肉样品分离到的17株单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)进行了基因分型,探讨了单增李斯特菌基因型与区域分布及流行性的关联性。结果表明,17株单增李斯特菌菌株可分为六个主要基因类群,其中Ⅳ型菌株最多,为主要污染类群,而这些菌株来自于市场三;市场一和市场二分离到的菌株主要分别为Ⅰ型和Ⅳ型。因此,ERIC-PCR方法适用于对单增李斯特菌的溯源分析和流行病学调查,具有简单、方便、快捷、准确的特点。

ERIC-PCR图谱分析生物栅填料生物膜微生物群落结构

采用以填料生物膜和水生植物为主体，以微生物、浮游植物、水生动物为要素的生物栅集成装置，处理上海市某一富营养化水体，实验采用6m^3／d的中试规模，7个廊道并联运行，连续进出水．测试进出水的理化指标，并采用ERIC—PCR指纹图谱技术对生物栅填料生物膜微生物进行分析．结果显示，生物栅技术对富营养化水体的污染物降解效果显著，稳定运行后，采用设置生物栅的2～7号净化池的COD、总氮、氨氮、总磷的去除率较对照池分别提高了20．7％～48．5％、20．1％～49．7％、39.8％～66．2％和60．0％～73．9％．水生植物有利于水体氮、磷的吸收和去除，设置水生植物的2号、5号、6号净化池对总氮去除率较未设置水生植物的3号、4号和7号净化池分别提高了30．1％、24．9％、17．6％，总磷的去除率也都提高了10％以上．ERIC-PCR指纹图谱分析显示，设置水生植物的3个净化池微生物群落结构相似，且微生物种类较未设置植物的净化池丰富．指纹图谱在第2d、第15d、第30d的微生物多样性指数分别为1．89～2．22、2．17～2．43和2．28～2．68，平均相似系数分别为71．8％、86．9％和91．0％，表明随着系统的运行微生物多样性指数逐渐增大，条带的相似性逐渐增加，系统中微生物种群趋于多样化，结构趋于稳定，污染物降解效率也同步提高．

不同的DNA提取法对两种常见医院感染菌ERIC-PCR鉴定的影响研究

目的研究不同基因组DNA提取方法,对肠杆菌基因间保守重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)鉴定两种菌株的影响。方法采用5种基因组DNA提取法,分别为化学裂解酚/氯仿法、玻珠击打法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法对1株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌基因组DNA进行提取,在相同的扩增条件下对不同方法提取的DNA模板进行ERIC-PCR。结果不同菌株基因组DNA经ERIC-PCR扩增后产生不同的电泳图谱,而用不同方法提取同一菌株DNA可以得到非常相似的电泳图谱。结论Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法、水煮法可以作为操作简单的DNA提取法用于细菌基因分型。

ERIC-PCR方法鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌研究

本研究工作共收集食物样品6种62份,从中分离单核细胞增生性李斯特氏菌可疑菌落,用ERICPCR方法进行鉴定,并用国标生化方法验证.结果表明,两种鉴定方法结论完全一致.证明使用ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌是可行的,并且耗时短、操作简单.

淡水养殖动物致病性嗜水气单胞菌ERIC-PCR分型与耐药性

以质控菌株ATCC7966为对照,采用ERIC-PCR方法对49株分别采集于中国浙江、江苏、江西、广东、湖北、上海等主要淡水养殖区的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了基因分型,并分析了嗜水气单胞菌对12种抗生素的耐药模式,探讨了嗜水气单胞菌的基因型与区域性分布及其耐药性的关联性。实验结果表明,50株受试嗜水气单胞菌菌株可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ这12个基因型,其中Ⅷ型菌株最多,Ⅲ型和Ⅹ型菌株最少。此外,50株受试菌株对氨苄青霉素(AMP)的耐药率高达100%,对头孢氨苄(CX)的耐药率高达98%,94%以上的菌株对氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素未产生耐药性。受试菌株对12种抗生素呈现出AMP、CX/AMP、CX/AMP/POL(多黏菌素)、CX/AMP/SMZ(复方新诺明)、CX/AMP/NM(新霉素)、CX/AMP/SMZ/POL、CX/AMP/SMZ/POL/GM(庆大霉素)、CX/AMP/SMZ/LOM(洛美沙星)/ENR(恩诺沙星)、CX/AMP/SMZ/LOM/ENR/OF(氧氟沙星)/LEV(左氟沙星)这9种不同的耐药模式,其中Ⅻ型菌株的耐药谱均为CX/AMP/POL型,Ⅱ型和Ⅺ型菌株的耐药谱多为CX/AMP/SMZ型,Ⅳ型、Ⅵ型和Ⅷ型菌株的耐药谱多为CX/AMP型,Ⅹ型菌株的耐药谱为CX/AMP/NM型。据此推测,嗜水气单胞菌基因型与耐药性可能存在一定的相关性。

代表活性污泥中苯酚降解菌群的ERIC-PCR产物片段的多态性

对可能代表活性污泥中两个时期的主要苯酚降解菌群的 ERIC- PCR指纹图谱中的两条 2 .1 kb的条带 ( P1和 P8)中的 DNA片段进行克隆、转化 ,得到 1 93个转化子。 H inf I物理图谱分析得到 35种酶切类型 ,将两端各进行 1次测序后 ,同源性大于 90 %的克隆归为一类 ,共得到 1 0种序列类型。对各类型的代表克隆进行了全长测序 ,5种类型为 P1条带所有 ,3种类型为 P8所有 ,二者共享的类型为 2种 ,丰度最高的片段为 S3,P1条带中 76.3%的转化子和 P8条带中 66.7%转化子属该类型。对所得序列进行检索分析 ,它们与 Gen Bank中已知基因序列均无显著同源性。用 S3特异性引物对活性污泥样品及其它在 LB、d CGY、MP和 FWM培养基上的回收菌进行扩增 ,除 LB上的回收菌没有显示目的条带外 ,活性污泥和其回收菌中均检测到带有该基因组片段的菌种的存在。

ERIC-PCR在人工混合菌体系中的检出灵敏度

提取大肠杆菌DH5α和阴沟肠杆菌 (E 2 6R)的基因组DNA ,进行ERIC PCR ,可以分别得到稳定而独特的DNA指纹图谱 ;模板量的变动范围从 1 0～ 1 0 0ng都不会影响其图谱的稳定性 ;在图谱中DH5α和E 2 6R各自均有一条含量最大的特征带 ,其不易受实验环境和实验条件的干扰而发生变化。把DH5α和E 2 6R按比例混合 ,提取混合菌基因组DNA ,进行ERIC PCR ,结果表明 :混合菌的DNA指纹图谱为各纯菌图谱的叠加 ,亦具有稳定性 ;通过对凝胶电泳图谱中特征带的分析 ,可以看出 :当DH5α的菌含量达到总菌量的 0 5 %时 ,可被ERIC PCR方法清楚地检测出来。为ERIC PCR用于土壤微生物和环境微生物的研究 。

焦化废水处理系统微生物群落结构动态的ERIC-PCR指纹图谱分析

ERIC PCR群落指纹图谱监测与常规技术相结合 ,分析了焦化废水处理系统曝气池的微生物群落结构动态变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系 .在每 3d 1次 ,连续 8个时间点的监测中 ,待处理废水中苯酚负荷在 35 5 3mg L和132 82mg L之间波动 ,氰化物负荷从 0 96mg L变化到 34 75mg L ,CODCr最低为 10 4 4 10mg L ,最高时为 7930 90mg L .第 4监测期间高浓度矿物油冲击使活性污泥的沉降能力和对CODCr的降解效率显著降低 ,但对苯酚和氰化物的降解能力造成的影响较小 .监测期间 2个曝气池微生物群落的ERIC PCR指纹图谱的平均相似性系数 (Cs)分别为 94 1%和 96 6 % ,多样性指数在 1 77— 2 34和 1 6 0— 2 16之间 ,表明用ERIC PCR检测出的该系统中的活性污泥这部分微生物种群的结构比较稳定 ,可能构成了苯酚和氰化物去除效率在监测期间相对稳定的基础 .

大肠杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步应用

为建立高效、敏感的肠杆菌科基因间重复一致序列PCR（ERIC-PCR）的分子分型方法,该研究提取大肠杆菌基因组DNA,以此为模板建立和优化ERIC-PCR分型体系,并采用ERIC-PCR方法对62株大肠杆菌进行分子分型和遗传相似性统计分析。结果显示从提取的大肠杆菌基因组中能够扩增到2~8条DNA片段,且大部分片段在100 bp至2 000 bp之间。通过4因素3水平正交试验,建立了较为稳定的ERIC-PCR分型方法。利用ERIC-PCR方法可将62株菌分为20型,其中以A型为优势菌群。遗传相似性结果表明,各菌株之间遗传相似性有较大的变化,但部分菌株高度同源。聚类分析表明,ERIC-PCR的分辨率系数为0.937,具有较高的分辨能力。表明应用ERIC-PCR分型技术在分子水平上对大肠杆菌进行鉴别和分型,具有简便和分辨力高等优点,能够对病原进行溯源分析,在大肠杆菌的分子流行病学研究中具有广泛的应用前景。

大肠杆菌MG1655菌株ERIC-PCR图谱主带序列组成分析

ERIC PCR已经在细菌分类、鉴定及混合菌群分析中得到广泛应用 ,但对其产物形成规律的认识仍存在分歧。以大肠杆菌MG1 655为对象 ,对其ERIC PCR指纹图谱中 1 1kb主带中的DNA片段进行了克隆、测序、基因组定位以及引物匹配分析。结果表明 ,这条1 1kb主带由分布在基因组中不同位置的 3种序列不同的片段组成 ,各片段的丰度差异较大 ,最高为 97 89% ;3种片段中的 2种所在的基因组区域仅一端含有ERIC序列。推测对含有ERIC序列的基因组DNA进行扩增时 ,ERIC PCR是一种非随机扩增。

ERIC-PCR指纹图谱技术分析糖尿病小鼠肠道细菌群落变化

目的通过比较1型糖尿病模型组和空白对照组雄性小鼠肠道菌群结构的变化,探索糖尿病造模与肠道菌群的关系。方法收集造模2周后空白对照组(n=5)、STZ造模成功组(n=5)和造模不成功组(n=3)ICR小鼠的新鲜粪便样品,提取粪便样品的总DNA,ERIC-PCR扩增形成DNA指纹图谱,借助多变量统计分析方法研究各组样品肠道菌群结构上的异同。结果ERIC-PCR指纹图谱结合偏最小二乘法(PLS-DA)分析表明造模成功组和造模不成功组小鼠的肠道菌群结构显著区别于空白对照组,而造模不成功组小鼠的肠道菌群结构与造模成功组仍有一定的区别。结论STZ诱导的1型糖尿病会造成小鼠的肠道菌群结构的变化,而部分小鼠造模失败可能与这些小鼠的肠道菌群结构有关。