青蛤(Cyclina sinensis)ERK基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) ERK基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到Cs ERK基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI:C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]ERK基因序列全长为2 407 bp,开放阅读框长1 338 bp,共编码445个氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高,闭壳肌中表达量最低。青蛤ERK基因在Poly I:C胁迫下表达量在6 h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。

厚壳贻贝细胞外调节蛋白激酶基因McERK的克隆及其在附着变态中的作用

为解析细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)基因(McERK)在厚壳贻贝(Mytilus coruscus)附着变态过程中的作用机制,采用RACE技术、系统进化分析和Real-time PCR等方法,对McERK基因分子特点和表达情况进行了研究。结果表明:McERK基因序列全长为1236 bp,开放阅读框为846 bp,可编码281个氨基酸,具有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域S_TKc;系统进化树分析显示,厚壳贻贝与加州贻贝(M.californianus)、地中海贻贝(M.galloprovincialis)和欧洲贻贝(M.edulis)的ERK聚为一支,且与欧洲贻贝序列的一致性最高(74.27%);荧光定量PCR分析显示,McERK基因在厚壳贻贝成贝各组织中广泛表达,在外套膜、唇瓣、鳃和血细胞中均有较高的表达量,其在担轮幼虫到稚贝的各个发育阶段均有表达,且在眼点幼虫阶段的表达量显著高于稚贝阶段(P<0.05);利用RNA干扰技术敲降眼点幼虫McERK基因后,幼虫变态率显著降低(P<0.05)。研究表明,McERK基因可能参与调控厚壳贻贝幼虫附着变态过程,本研究结果可为探究McERK调控厚壳贻贝的发育过程提供数据支持。

胃癌高表达基因erk的PCR扩增、克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．

猪繁殖候选基因ERK2的电子克隆与生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法对猪细胞外信号调节激酶2(Extracellular signal-regulated kinase 2,ERK2)基因的结构、表达和功能进行了分析,结果表明:(1)电子克隆获得的猪ERK2基因cDNA全长1 803 bp,包括1 080bp的编码区和200 bp 5'UTR、523 bp 3'UTR,编码合成359个氨基酸的多肽;(2)猪ERK2基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为94.6%、91.6%和91.3%,编码合成的猪ERK2与人、小鼠和大鼠之间的同源性也高达99.4%、98.9%和98.9%;(3)猪ERK2蛋白的相对分子质量为41 303.69 Da,不含信号肽,具有ATP结合位点、MAP激酶保守位点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点等结构域;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪ERK2基因在卵巢、睾丸、肾上腺、眼、肺、淋巴、关节囊、副乳、未成熟的树突状细胞和脂肪细胞等组织和细胞中表达。

猪繁殖候选基因ERK2的克隆、表达及基因多态分析

【目的】ERK2基因在细胞增殖和分化调控以及启动卵巢排卵的分子信号等过程中发挥重要作用,是影响猪繁殖性状的重要候选基因。本试验对猪ERK2基因序列、基因结构、基因多态性及其表达规律进行初步研究。【方法】以大白猪为材料,采用RT-PCR方法克隆了猪ERK2基因,Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的分布,并对该基因的结构和多态性进行分析。【结果】从猪卵巢组织中克隆获得ERK2基因部分cDNA序列,长1 888 bp,包括一个1 080 bp的开放阅读框,编码359个氨基酸与预测的猪ERK2基因、已报道的人和小鼠等的ERK2基因高度相似;猪ERK2基因在各组织中表达广泛,其中脾脏是表达量最高的组织,在脂肪组织、前后腿肌中基本不表达;猪ERK2基因定位于14号染色体,全长在22 kb以上,包含9个外显子和8个内含子;对第2—9外显子及内含子外显子交界处的内含子序列进行序列突变检测,共检测到11个SNPs和1个插入缺失突变,但绝大部分的变异都是在内含子区域,仅有1个SNP发生于3′UTR区域。【结论】猪ERK2基因cDNA为1 888 bp,编码359个氨基酸残基;在猪各组织中广泛分布,以脾脏的表达量最高;该基因由9个外显子和8个内含子组成,基因保守性较高,共检测到11个SNP和1个插入缺失突变均不在编码区中。

猪ERK6基因编码区的克隆及组织表达谱分析

利用RT-PCR方法扩增了猪ERK6基因编码区的序列,将扩增产物与pMD18-T载体连接,构建了重组质粒;重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;采用Northern杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同部位骨骼肌中分析了ERK6基因转录本的个数、大小及组织表达谱。结果显示,所克隆的猪ERK6基因片段长1 113 bp,含有1个1 104 bp的开放阅读框(ORF),该ORF编码367个氨基酸;该基因与已报道的人ERK6基因核苷酸序列相似性为90%;猪ERK6基因在肌肉组织中只有一个转录本,大小约1.5 kb。此基因在骨骼肌中的表达量最高,心、子宫次之,卵巢最低;而在脂肪、胃、肝、脾、肺、肾、十二指肠和胰腺中未见表达。结果表明,猪ERK6基因与已报道的小鼠和人ERK6基因一样,主要在骨骼中特异表达。

反义ERK2基因对结缔组织生长因子诱导肾小管上皮细胞向间充质转化的调控效应

目的研究细胞外信号调节激酶2(ERK2)信号转导通路对结缔组织生长因子(CTGF)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转化的调控效应。方法腺病毒介导的反义ERK2基因(Adanti-ERK2)按感染强度50、100、200转染HK-2细胞,确定最适感染强度。按作用因素的不同将HK-2细胞分为对照组、Ad-LacZ组、CTGF组和Adanti-ERK2组。免疫组织化学检测E-Cadherin和Vi mentin的表达,Western blot法检测E-Cadherin、Vi mentin及ERK2的表达变化;细胞接种Boyden小室1、3、5 d时检测各组HK-2细胞迁移数目的变化。结果①Adanti-ERK2转染HK-2细胞最适感染强度为100。②HK-2细胞在CTGF刺激下E-Cadherin蛋白表达明显减少,Vi mentin表达增加,同时细胞内的ERK2蛋白表达显著增加;而Adanti-ERK2组E-Cadherin和Vi mentin表达变化不明显,ERK2蛋白表达较对照组明显减少。③接种5 d,HK-2细胞在CTGF刺激下细胞运动能力显著高于其他各组,而Adanti-ERK2组与对照组和Ad-LacZ组相比差异无显著性意义。结论以反义ERK2基因治疗可以有效阻断CTGF诱导的肾小管上皮细胞向间充质转化。提示ERK2信号转导通路在该转化中发挥重要作用。

猪ERK6基因3′UTR的克隆及序列分析

为了给猪ERK6基因的功能研究提供信息资料,试验以已报道的猪ERK6基因CDS序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增了猪ERK6基因3′UTR序列,并采用DNAMAN、DNASTAR及CLUSTALW2软件分析序列特征。结果表明:分离的产物共827bp,包含部分编码区281bp、3′UTR序列439bp、poly(A)60、接头引物47bp,将前三部分序列共780bp上传至GenBank,登录号为NM_001025224;此序列poly(A)60位点上游14个核苷酸处有CPSF结合位点,与人、鼠3′UTR序列的相似性为41%、48%。说明分离获得的片段为猪ERK6基因的3′UTR序列。

HeLa细胞中ERK8突变基因的发现

目的:检测HeLa细胞中ERK8基因的表达并对其进行序列分析。方法:Westernblot检测HeLa细胞中ERK8蛋白的表达。提取HeLa细胞中的RNA,用RT-PCR方法得到ERK8基因片段,克隆后进行序列测定和分析。结果:首次发现HeLa细胞中存在ERK8基因突变:ERK8 S192P。结论:ERK8基因在HeLa细胞中的表达及其突变的发现,为进一步研究ERK8突变体在HeLa细胞中的功能研究奠定基础。

衣被蛋白复合体-亚基β2调控ERK/MEK通路在下咽癌中作用的研究

目的分析衣被蛋白复合体-亚基β2(coatomer protein complex subunit β2,COPB2)在下咽癌发生发展中的作用及机制。方法应用TCGA数据库分析COPB2在下咽癌中的表达水平,并在下咽癌细胞系(FaDu)中检测COPB2基因敲减后对细胞增殖的影响,探索COPB2在下咽癌细胞增殖中的作用。Western blot分析COPB2基因可能的作用机制及通路。结果通过TCGA数据库数据分析566例组织样本测序信息,相较于癌旁组织,COPB2基因在下咽癌组织中高表达(t=-3.098,P=0.005),并在肿瘤组织样本中得到验证。体外实验显示,COPB2敲减后抑制细胞增殖(敲减组平均表达量为43.400,空白对照组为105.600,P=0.000),过表达后促进细胞增殖(P=0.011)。COPB2的调控可能是通过ERK/MEK信号通路发挥作用。结论 COPB2基因在下咽癌的发生发展中起到一定的作用,并对ERK/MEK通路产生影响。

ERK干扰质粒的构建及对胃癌细胞株BGC823 DcR3表达的影响

目的探讨胃癌发展的分子机制,通过构建ERK1/2shRNA真核表达载体,体外研究其对人胃癌细胞株BGC823ERK1/2蛋白及DcR3表达水平的影响。方法应用PRNAT-U6.1/Neo载体构建ERK1/2基因shRNA重组质粒,经脂质体法导入BGC823细胞中,分别设置对照组、干扰组和U0126抑制剂组。Westernblot法检测转染后BGC823细胞及抑制剂使用后ERK1/2蛋白的表达变化,荧光显微镜检测质粒自带GFP基因的表达情况确认转染效率,ELISA法检测各组细胞上清中DcR3分泌蛋白的表达特点。结果成功构建ERK1/2基因shRNA重组质粒。证明了ERK1/2蛋白的表达与DcR3的分泌水平在BGC823细胞株中呈正相关。结论 ERK1/2干扰质粒明显降低BGC823细胞的ERK1/2蛋白表达水平,ERK信号通路对DcR3的分泌具有重要调控作用,为其下游调控机制的研究奠定了基础。

猪ERK6基因cDNA序列及功能分析

克隆猪ERK6基因cDNA序列,分析其生物学特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。据已报道的人及小鼠ERK6基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术和3′RACE扩增猪ERK6基因序列,并进行序列测定。结果表明:分离cDNA共1 603 bp,其中包含ORF全长1 101 bp,编码367个氨基酸,与人、鼠氨基酸序列92%同源;利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级和二级结构。

猪细胞外信号调节激酶6(erk6)基因cDNA的克隆及表达谱分析

以人及小鼠erk6基因cDNA序列为依据设计引物,RT-PCR技术和3'RACE扩增猪erk6基因序列。Northern杂交分析erk6基因在肌肉组织中的转录本大小;半定量RT-PCR方法分析此基因的组织表达谱。结果,分离cDNA共1 603 bp,其中包含ORF全长1 101 bp,编码367个氨基酸,与人、鼠erk6基因cDNA序列相似性分别为90%和85%。Northern杂交分析猪erk6基因在肌肉组织中只有一个转录本,大小约1.5 kb;半定量RT-PCR方法分析结果显示,猪erk6基因在骨骼肌中高表达,心、子宫次之,卵巢最低。本研究通过分析,获取了该基因的基本信息特征以及在猪各组织中的表达情况,为进一步开展猪erk6基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。

Development of a high-content screening method to evaluate the cellular population-based biological activity of new siRNA delivering reagent

Normally, cellular responses to modified siRNAs or new siRNA delivery systems have been studied in group cell behavior by PCR, western blotting and fluorescence microscopy. In this study, we present a novel high-content screening （HCS） strategy to evaluate a novel delivery system （named CLD） of siRNA therapeutics, with which both the content of intracellular siRNAs and changes in protein expressing levels have been quantified in group cells and cellular population. We also observed that with the better cell uptake, CLD provided siRNA therapeutics （siBraf） better antitumor capability. This novel strategy was proved to be with efficiency, accuracy and high competency to adherent cell lines, thus making siRNA research more simplified.