WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制人脐带间充质干细胞CD200表达抑制巨噬细胞M2极化

目的探究白细胞介素1β(IL-1β)调控人脐带间充质干细胞CD200表达及其对巨噬细胞极化的影响及作用机制。方法无血清培养基分离培养获得人脐带间充质干细胞(hUC-MSC),形态学观察及流式细胞术检测CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)的表达,确定间充质干细胞属性;20 ng/mL IL-1β处理hUC-MSC 24 h,流式细胞术检测CD200阳性细胞率,实时定量PCR和Western blot法检测CD200 mRNA和蛋白表达水平;佛波酯(PMA)诱导THP-1巨噬细胞活化,并与IL-1β处理感染CD200过表达慢病毒的hUC-MSC共培养,流式细胞术检测CD11c和CD206阳性细胞比例;IL-1β联合细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂PD98059处理hUC-MSC,Western blot法检测细胞丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号分子与CD200的表达。结果IL-1β显著下调hUC-MSC CD200蛋白表达与CD200阳性细胞率;过表达CD200显著上调hUC-MSC CD200表达,且CD200过表达hUC-MSC提高巨噬细胞CD206阳性细胞比率;IL-1β激活hUC-MSC的ERK1/2信号通路,PD98059上调IL-1β处理后hUC-MSC中CD200的蛋白表达。结论IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制CD200的表达,进而抑制hUC-MSC对巨噬细胞向M2型极化的促进作用。

ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路介导对老年大鼠骨骼保护作用

【目的】探讨桑黄素(SSS)治疗对老年大鼠骨代谢及骨量影响,并阐明其可能的作用机制。【方法】10只3月龄年轻雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠和20只24月龄老年雌性SD大鼠随机分为3组,对照组(CON,10只年轻大鼠)、模型组(MOD,10只老年大鼠)和桑黄素组(SSS,10只老年大鼠)。在实验过程中,SSS组每日接受腹腔注射桑黄素(10 mg/kg)治疗。治疗为期12周,待治疗结束后使用Micro-CT、HE染色切片、血清学检测以及蛋白质印迹观察治疗效果以及可能的机制。【结果】治疗12周后,与MOD组相比,SSS组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善。SSS组左侧股骨BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp较MOD组明显改善(P<0.05)。治疗12周时,SSS组CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平较MOD显著降低(P<0.05)。和MOD组比较,SSS组的大鼠ERK1/2-p38信号通路显著抑制,ERK1/2和p38水平显著降低,比较有统计学差异(P<0.05)。【结论】桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路和降低骨转换来介导对老年大鼠骨骼保护作用。

温肺降浊方对血管性痴呆模型大鼠ERK1/2信号通路相关蛋白的影响

目的:观察温肺降浊方对血管性痴呆(VaD)模型大鼠细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路的影响,探讨其治疗VaD可能的相关作用机制。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组和模型组(等体积0.9%氯化钠溶液灌胃),温肺降浊方低、中、高剂量组(1.5、3、6 ml剂量灌胃)。观察造模后大鼠水迷宫评分和HE病理变化,免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测海马组织中ERK1/2、钙蛋白酶(Calpain)、Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)、B淋巴细胞瘤-xl(Bcl-xl)蛋白和mRNA表达情况。结果:与假手术组相比,模型组和温肺降浊方各剂量组大鼠逃避潜伏期延长、穿越平台次数缩短(P<0.05),海马组织形态稀疏、水肿及核缩小;海马组织ERK1/2、Calpain、Bad蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),Bcl-xl蛋白和mRNA表达下降(P<0.05)。与模型组比较,温肺降浊方高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加(P<0.05),海马组织形态逐渐紧密、水肿减少,数量增多;海马组织ERK1/2、Calpain、Bad蛋白和mRNA表达下降(P<0.05),Bcl-xl蛋白和mRNA表达升高(P<0.05)。结论:血管性痴呆可能与大鼠海马中的ERK1/2、Calpain、Bad蛋白升高及Bcl-xl蛋白降低有关,温肺降浊方可以抑制VaD大鼠海马中的ERK1/2通路激活,减少神经细胞凋亡,延缓疾病进展,改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。

基于PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎小鼠的影响

目的观察补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路的影响,探讨其治疗AIT的作用机制。方法80只8周龄NOD.H-2^(h4)小鼠随机分为对照组、模型组、中药组和硒酵母片组,每组20只。对照组饮用蒸馏水,其余各组予0.05%碘化钠溶液自由饮用8周建立AIT小鼠模型。各给药组灌胃给予相应药物给药8周。HE染色观察甲状腺组织形态,ELISA测定血清甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)含量,RT-qPCR检测甲状腺组织蛋白激酶Cβ(PKCβ)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)、核因子(NF)-κBp65、维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)和白细胞介素(IL)-17 mRNA表达,Western blot检测甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠甲状腺组织出现大量淋巴细胞浸润,血清TGAb、TPOAb含量明显升高(P<0.001),甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.001);与模型组比较,中药组和硒酵母片组小鼠甲状腺组织淋巴细胞浸润减轻,血清TGAb、TPOAb含量明显降低(P<0.001),甲状腺组织PKCβ、Erk1/2、NF-κBp65、RORγt、IL-17 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.001),中药组与硒酵母片组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论补中益气汤可能通过调控PKCβ/Erk1/2/NF-κB信号通路减轻AIT小鼠炎症反应,改善甲状腺组织淋巴细胞浸润状态。

调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌

目的 探究调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)稳定期大鼠气道黏液高分泌的影响及作用机制。方法 90只大鼠随机分为对照(Control)组、模型(COPD)组、补肺健脾(Bu-Fei Jian-Pi Formula, BJF)组、补肺益肾(Bu-Fei Yi-Shen Formula, BYF)组、益气滋肾(Yi-Qi Zi-Shen Formula, YZF)组、ERK1/2抑制剂(PD98059)组、补肺健脾联合抑制剂(BJF+PD98059)组、补肺益肾联合抑制剂(BYF+PD98059)组和益气滋肾联合抑制剂(YZF+PD98059)组。第1~8周采用香烟烟雾暴露联合细菌反复感染的方法建立COPD大鼠模型,9~16周Control组和COPD组给予生理盐水每只2 mL,BJF组、BYF组和YZF组分别给予对应的调补肺肾三方灌胃,第16周PD98059组、BJF+PD98059组、BYF+PD98059组和YZF+PD98059组给予PD98059腹腔注射7 d。16周结束后取材,检测大鼠肺功能、肺组织形态、肺组织水含量、BALF中炎性细胞计数和血清炎性因子水平。AB-PAS染色和免疫组化法分别检测杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达。PCR检测ERK1、ERK2、ENaC、CFTR、AQP5 mRNA表达。Western Blot测定肺组织中ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达。结果 与Control组相比,COPD组大鼠TV、MV、FVC、FEV_(0.1)及FEV_(0.1)/FVC均显著下降(P<0.01);肺病理显示肺泡紊乱,肺泡壁大量断裂,气管壁严重皱缩增厚,周围有大量炎性细胞浸润;肺组织水含量明显升高(P<0.01);BALF中巨噬细胞比例显著降低(P<0.01),中性粒细胞和淋巴细胞比例显著升高(P<0.01);血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平显著增高(P<0.05,P<0.01);气道上皮杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达水平均显著升高(P<0.01);肺组织ERK1、ERK2、ENaC mRNA表达量均明显升高(P<0.01),CFTR和AQP5 mRNA的表达均明显降低(P<0.01);肺组织P-ERK1/2, ERK1/2表达明显升高(P<0.01);与COPD组相比,各治疗组能不同程度改善上述指标变化(P<0.05,P<0.01),调补肺肾三方联合PD98059组治疗效果优于单一治疗组(P<0.05,P<0.01)。结论 调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌。

POSTN通过ERK1/2信号通路诱导肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探索骨膜蛋白(periostin,POSTN)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖在缺氧诱导肺动脉高压(hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)发病中的作用及其机制。方法取自雄性大鼠的原代PASMC暴露于缺氧环境模拟HPH,将细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+对照腺病毒转染组(Ad-shNC组)、缺氧+POSTN沉默腺病毒转染组(Ad-shPOSTN组)、POSTN组、POSTN+U0126组。采用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)评估PASMC的纯度,CCK-8法检测细胞活力,Western blot法检测PASMC中POSTN、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein typeⅡreceptor,BMPR2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)及细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的蛋白表达水平。结果与常氧组比较,缺氧促进PASMC增殖和POSTN蛋白表达,抑制BMPR2蛋白表达。下调POSTN表达可抑制缺氧诱导的PASMC增殖,恢复BMPR2蛋白表达水平。此外,POSTN明显增加p-ERK1/2或ERK1/2的蛋白表达水平,增加PASMC增殖,而这些效应可被U0126阻断。结论在HPH病理机制中,POSTN促进PASMC增殖,其潜在的机制可能与调节BMPR2表达和活化ERK1/2信号通路有关。

TNF-α通过ERK1/2-Runx2信号通路调控SHED成骨分化能力的实验研究

目的:探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)骨分化能力的影响,分析ERK1/2-Runx2信号通路在该调控过程中的变化。方法:从6~8岁健康儿童正常乳恒牙替换即将脱落的乳切牙中分离和培养SHED,取第三代细胞,分为对照组(成骨诱导剂培养)、观察组(成骨诱导剂和TNF-α共培养)和激动剂组(成骨诱导剂、TNF-α和ERK通路激动剂共培养)。采用茜素红染色评价成骨分化功能,采用Western印迹检测SHED细胞中Osterix、OPN、ERK1/2、pERK1/2和Runx2的蛋白表达水平,应用qRT-PCR检测Osterix、OPN、ERK1/2、pERK1/2和Runx2 mRNA的表达。采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学分析。结果:3组细胞成骨分化能力比较结果显示,3组细胞中均可见红棕色矿化结节。3组组间相比,对照组矿化结节最多,激动剂组次之,观察组最少。与对照组相比,观察组和激动剂组的Osterix、OPN蛋白和mRNA表达水平显著下降,而激动剂组Osterix、OPN蛋白和mRNA表达水平显著高于观察组;3组细胞的ERK1/2蛋白和mRNA表达水平无显著差异,而观察组和激动剂组pERK1/2和Runx2的蛋白和mRNA表达水平显著高于对照组,激动剂组的蛋白及mRNA表达水平显著高于观察组。结论:TNF-α对SHED成骨分化具有抑制作用,该作用可能与抑制ERK1/2-Runx2信号通路有关。

基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响

目的 研究基于细胞外信号调节激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响。方法 40只SD大鼠随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余建立慢性肾衰竭(CRF)模型,建模成功后分为模型组、治疗组(芪黄苁蓉通便散贴)、药物对照组(复元四红散)各10只。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾功能、氧化应激相关指标水平,苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察肾组织病理形态学,采集粪便检测肠道细菌种类及数量,Western印迹检测ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白。结果 与健康组相比,模型组尿素氮、血肌酐、尿酸、丙二醛、肠球菌、肠杆菌、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1升高,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、双歧杆菌、乳酸杆菌水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善,且以治疗组效果显著(P<0.05)。健康组肾组织结构正常;模型组肾小球变形,肾小管扩张,大量炎性细胞浸润;与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善。Masson染色显示,健康组结构正常;模型组出现肾组织肾小管发生变性、萎缩、破坏及再生等病理改变,间质中单核与淋巴细胞浸润及胶原纤维表达最多;治疗组与药物对照组肾小管、间质的病理改变得到有效改善,蓝色胶原纤维沉积也呈下降趋势。结论 芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1-2-GSK3β-NF-κB通路的激活,改善CRF大鼠肠道菌群及肾功能。

补脾益肾通络方治疗G1A2期糖尿病肾病临床研究

目的探讨补脾益肾通络方对G1A2期糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)患者的临床疗效。方法选取2019年12月—2021年11月在辽宁中医药大学附属医院内分泌科门诊或住院的DKD患者共106例,按随机数字表法分为对照组与观察组各53例。对照组予西医常规治疗,观察组在对照组基础上联合补脾益肾通络方口服,共12周。比较两组患者治疗后有效率、治疗前后尿白蛋白/尿肌酐(urinary albumin/urinary creatinine,UACR)、α1微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D glucosaminidase,NAG)、视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein,RBP)、肾功能、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose,2 h PBG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)及安全性指标。结果两组患者治疗前所有指标均具有可比性;观察组总有效率82.69%(43/52),优于对照组的68.62%(35/51),差异有统计学意义(P<0.05);与治疗前比较,两组患者治疗后UACR、α1-MG、β2-MG、NAG、RBP水平显著下降(均P<0.01)。与对照组比较,观察组治疗后UACR、β2-MG、NAG、RBP水平下降(P<0.05);两组患者治疗前后肾功能无明显变化;与治疗前比较,两组治疗后HbA1c、FBG,2 h PBG水平均下降(均P<0.01)。与对照组比较,观察组HbA1c、FBG水平下调(P<0.05);与治疗前比较,两组患者治疗后TC、TG水平显著下降(均P<0.01),LDL-C、HDL-C水平变化具有统计学意义(均P<0.05);治疗后与对照组比较,观察组TC、TG水平下降(P<0.05);两组患者安全性指标均在正常范围内,无不良反应发生。结论补脾益肾通络方治疗G1A2期DKD临床疗效显著,安全性良好,值得临床推荐。

ERK1/2信号通路与肿瘤关系的研究进展

胞外信号调节激酶(ERK)可以将细胞信号从受体传导至细胞核,是负责细胞外刺激的经典丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。相关研究表明ERK通路的激活与许多肿瘤的发生发展密切相关,许多作用于ERK通路上游的抑制剂都表现出抗肿瘤活性。ERK1和ERK2是MAPK/ERK通路最重要的分子,因具有同质性,统称为ERK1/2。ERK1/2可以磷酸化多种底物,参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭、凋亡、癌性转化等重要过程。本文就ERK1/2信号通路及其与肿瘤增殖、凋亡和迁移侵袭的相关性进行综述,以期更好的指导肿瘤治疗。

双路通脑方调节SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的影响

目的探讨双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的作用以及对沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路的调节机制。方法采用随机数字表法选取20只大鼠作为假手术组,剩余70只大鼠均利用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、双路通脑方组、双路通脑方+SIRT1抑制剂组(双路通脑方+EX527组),每组20只。14 d后,对大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测大鼠脑梗死面积;HE染色检测大鼠脑组织病理变化;尼氏染色检测大鼠脑组织神经元数量;试剂盒检测大鼠脑组织中铁离子(Fe^(2+))、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;免疫组化检测大鼠脑组织中酰基-辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)、转铁蛋白受体(TFR)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的阳性表达;Western blotting法检测大鼠脑组织中SIRT1、Nrf2、GPx4及胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组大鼠的神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达升高(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均降低(P<0.05);与模型对照组比较,双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达降低(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均升高(P<0.05);采用SIRT1抑制剂进行回补实验,结果显示SIRT1抑制剂逆转了双路通脑方对神经元铁死亡的抑制作用,同时也抑制了Nrf2和GPx4的表达(P<0.05)。结论双路通脑方可能通过激活SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路来抑制缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡。

circRNA_079813调控ROR2和ERK1/2-MAPK信号通路对牙髓损伤大鼠成骨分化的影响

目的:探讨circRNA_079813对牙髓损伤模型大鼠成骨分化的作用及其机制。方法:将70只SD大鼠随机分为7组,即假手术组、牙髓损伤组、pcDNA3.1空载体(pcDNA-null)+牙髓损伤组、过表达circRNA_079813(pcDNA-circ)+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组、pcDNA-circ+PD98059(ERK1/2抑制剂)+牙髓损伤组,每组10只。术后3 d采用苏木精—伊红(HE)染色观察牙髓组织病理变化。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,RTqPCR法检测circRNA_079813表达,western blotting法检测ROR2、磷酸化(p-)ERK1/2、骨涎蛋白(BSP)、骨钙蛋白(OCN)、ALP、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)蛋白表达。结果:与假手术组比较,牙髓损伤组牙髓组织有明显炎症浸润和损伤特征,circRNA_079813表达下调(P<0.05)。与pcDNA-null+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+牙髓损伤组circRNA_079813、ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达水平及ALP活性均升高(均P<0.05)。沉默ROR2表达后,与pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。与pcDNA-circ+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+PD98059+牙髓损伤组pERK1/2、ALP、BSP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。结论:circRNA_079813通过促进ROR2表达激活牙髓损伤大鼠ERK1/2-MAPK信号通路促进成骨分化。

促红细胞生成素衍生肽对表柔比星致大鼠心肌损伤ERK1/2信号通路的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)衍生肽(HBSP)对表柔比星(EPI)致大鼠心肌损伤的作用机制。方法雄性大鼠40只,随机分为正常对照(CON)组、EPI模型组、EPO治疗组和HBSP治疗组。采用EPI制作大鼠心肌损伤模型(2.5 mg/kg腹腔注射,每周1次,共6 w),EPO治疗组和HBSP治疗组在腹腔注射EPI前1 d、后1 d、后3 d分别腹腔注射rhEPO(5000 IU/kg)、HBSP(60μg/kg),共6 w。苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠心肌细胞形态结构;免疫组织化学法检测各组大鼠左心室心肌细胞色素(Cyt)C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9蛋白的表达。通过聚合酶链反应(PCR)检测大鼠心肌组织中细胞外信号调节激酶(ERK)1、ERK2 mRNA的表达。结果与CON组比较,EPI模型组心肌细胞损伤明显增加,心肌组织中CytC、caspase-9蛋白表达明显升高,ERK1、ERK2 mRNA表达水平显著降低(P<0.05);与EPI模型组比较,EPO治疗组及HBSP治疗组心肌细胞损伤明显降低,心肌组织中CytC和caspase-9蛋白表达明显降低,ERK1、ERK2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论HBSP通过激活ERK1/2信号通路,减少细胞凋亡线粒体途径相关CytC、caspase-9凋亡蛋白的表达,抑制EPI所致大鼠的心肌细胞损伤,从而起到心脏保护作用。

基于Nrf2/HO-1信号通路探讨冠心通络方对大鼠冠脉微循环障碍的影响

目的:探索冠心通络方通过核因子E2相关因子(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路对冠脉微循环障碍(CMD)大鼠的保护作用及其可能机制。方法:将雄性SPF级SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、尼可地尔(1.56 mg/kg)阳性对照组及冠心通络方低(8.663 g/kg)、中(17.325 g/kg)、高(34.650 g/kg)剂量组,每组10只,除假手术组外,其余5组采用左心室注射月桂酸钠(1 mg/kg)制备CMD大鼠模型。造模成功后冠心通络方各组分别给与相应剂量冠心通络方煎液灌胃,尼可地尔组灌胃尼可地尔混悬液,其余2组灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续灌胃28 d。超声心动图检测心功能后留取血清及心肌组织;Carstairs染色观察心肌组织微血栓形成情况,海登汉氏(Heidenhain)染色观察心肌组织微梗死情况;相应试剂盒检测血清NO、ET-1及心肌组织SOD、GSH-Px、MDA水平;Western Blot检测心肌组织Keap1、细胞质Nrf2及细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达;免疫组化法检测心肌组织中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心功能及血清NO水平和心肌组织SOD、GSH-Px水平显著降低,心肌微梗死、心肌内微血栓阳性比例及血清ET-1水平和心肌组织MDA水平显著升高,心肌组织Keap1蛋白、细胞质Nrf2蛋白表达显著降低,细胞核HO-1、Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,冠心通络方中、高剂量组大鼠心功能显著改善,心肌微梗死比例、微血栓阳性比例及血清ET-1和心肌组织MDA水平显著降低,血清NO水平及心肌组织SOD、GSH-Px水平显著升高,心肌组织Keap1蛋白、细胞质Nrf2蛋白表达显著降低,细胞核HO-1、Nrf2蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:冠心通络方能一定程度上改善CMD大鼠病理进程及心功能,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路表达,增加机体抗氧化能力有关。

津力达联合通心络通过Nrf-2/HO-1信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的干预作用

目的探讨津力达联合通心络通过核因子E2相关因子2(Nrf-2)/血红素氧合酶1(HO-1)信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的干预作用。方法将HUVECs分成正常对照组、模型组、津力达组、通心络组、联合用药组,正常对照组细胞采用含5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养,模型组、津力达组、通心络组、联合用药组细胞采用含30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养,津力达组加入200 mg/L的津力达贮存液,通心络组加入100 mg/L的通心络贮存液,联合用药组加入200 mg/L的津力达贮存液和100 mg/L的通心络贮存液。采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成数量,采用Transwell检测细胞侵袭能力,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用划痕实验检测各组细胞迁移率,采用ELISA检测各组细胞的炎症因子水平,检测各组细胞的氧化应激相关指标水平,采用Western blot检测各组细胞的Nrf-2、HO-1蛋白表达量。结果与正常对照组相比,模型组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均降低,细胞凋亡率升高,细胞间黏附分子(ICAM-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、丙二醛、乳酸脱氢酶(LDH)水平均升高,超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮、一氧化氮合成酶(NOS)水平及Nrf-2、HO-1蛋白表达量均降低(均P<0.05);与模型组相比,津力达组、通心络组和联合用药组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均升高,细胞凋亡率均降低,ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、丙二醛、LDH水平均降低,SOD、一氧化氮、NOS水平及Nrf-2、HO-1蛋白表达量均升高,且联合用药组上述指标均优于津力达组和通心络组(均P<0.05)。结论津力达和通心络均通过抑制炎症反应和氧化应激反应来减轻高糖所致的HUVECs损伤,且联合用药效果更好,其机制可能与激活Nrf-2/HO-1信号通路有关。

通过MAPK/ERK1/2信号通路探讨固本增骨方对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的探讨固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响及与MAPK/ERK1/2信号通路的关系。方法制备固本增骨方含药血清干预MC3T3-E1细胞,CCK-8法观察各组细胞增殖情况。ALP试剂盒、茜素红染色检测各组细胞成骨矿化能力。根据CCK-8检测、ALP活性检测与茜素红染色结果筛选最佳含药血清浓度及干预时间;将MC3T3-E1细胞分A、B、C、D 4组,分别加入空白血清、20%含药血清、空白血清+PD0325901、20%含药血清+PD0325901,采用RT-PCR检测各组细胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达水平,免疫印迹法Western blot检测各组细胞中ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组均能促进MC3T3-E1细胞增殖能力,提高ALP活性,其中20%含药血清干预48 h效果最为显著(P<0.05);茜素红染色后镜下观察在浓度为20%时染色区域钙结节数量最为密集;与A组相比,B组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平明显增高(P<0.05);加入阻断剂PD0325901后,C组与D组上述指标的表达明显降低(P<0.05);与D组相比,C组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平更低(P<0.05)。结论固本增骨方含药血清能促进MC3T3-E1细胞的增殖及矿化,并上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达,其作用机制可能与激活MAPK/ERK1/2通路有关。

ERK1/2信号通路在3种骨肉瘤细胞中的作用和表达水平的研究

目的观察细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)激动剂表皮生长因子(EGF)和抑制剂PD98059对3种骨肉瘤细胞株U2OS、MG63、UMR106的增殖影响以及ERK1/2基因和蛋白在3种细胞株中的表达水平,筛选出ERK1/2基因和蛋白表达最高的骨肉瘤细胞株用于后续实验研究。方法采用细胞计数和CCK8法分别测定U2OS、MG63、UMR106细胞的生长情况,同时使用EGF和PD98059分别干预3种细胞株,观察其对3种骨肉瘤细胞增殖的影响;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测3种细胞株中ERK1/2基因的表达;采用Western-blot检测3种细胞株中ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达情况。结果细胞计数和CCK8结果均显示,U2OS和UMR106在正常情况下培养48 h可达最佳生长状态,而MG63细胞的最佳生长状态时间为24 h;EGF在干预细胞24 h和48 h均能使U2OS、MG63、UMR106细胞增殖,而PD98059在干预细胞24 h和48 h均能使3种细胞的增殖受到抑制(P<0.05)。RT-qPCR结果显示在培养48 h后,U2OS细胞中的ERK1/2基因表达水平最高。Western-blot结果显示在培养48 h后,U2OS细胞中ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达水平最高,UMR106细胞次之,而MG63细胞中ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达水平最低(P<0.05)。结论U2OS细胞株生长期长,增殖活力强,同时ERK1/2基因、蛋白以及p-ERK1/2蛋白的表达水平高,适合用于骨肉瘤ERK1/2信号通路的研究。

PKD通过ERK1/2信号通路调控单核细胞增生李斯特菌感染Caco-2细胞

目的探讨蛋白激酶D(PKD)在单核细胞增生李斯特菌(Lm)感染Caco-2细胞中的作用及其机制。方法建立Lm感染Caco-2细胞模型,qRT-PCR检测PKD1、PKD2和PKD3 mRNA表达水平。加入PKD抑制剂CID755673后,Lm感染Caco-2细胞,CCK-8法测定细胞存活率,Western blot法检测细胞炎症相关蛋白和ERK1/2信号通路蛋白的表达。结果Lm感染促进Caco-2细胞表达PKD;与Lm组相比,抑制PKD可明显降低Caco-2细胞存活率(F=4.831,P<0.05),明显抑制炎症相关蛋白NLRP3、p-IκBα(F_(NLRP3)=35.02,F_(p-IκBα)=45.19,均P<0.01)和ERK1/2蛋白(F=326.9,P<0.001)的表达。结论PKD-ERK1/2信号通路在Lm感染Caco-2细胞中发挥重要调控作用。