叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路介导对老年大鼠骨骼保护作用

【目的】探讨桑黄素(SSS)治疗对老年大鼠骨代谢及骨量影响,并阐明其可能的作用机制。【方法】10只3月龄年轻雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠和20只24月龄老年雌性SD大鼠随机分为3组,对照组(CON,10只年轻大鼠)、模型组(MOD,10只老年大鼠)和桑黄素组(SSS,10只老年大鼠)。在实验过程中,SSS组每日接受腹腔注射桑黄素(10 mg/kg)治疗。治疗为期12周,待治疗结束后使用Micro-CT、HE染色切片、血清学检测以及蛋白质印迹观察治疗效果以及可能的机制。【结果】治疗12周后,与MOD组相比,SSS组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善。SSS组左侧股骨BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp较MOD组明显改善(P<0.05)。治疗12周时,SSS组CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平较MOD显著降低(P<0.05)。和MOD组比较,SSS组的大鼠ERK1/2-p38信号通路显著抑制,ERK1/2和p38水平显著降低,比较有统计学差异(P<0.05)。【结论】桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路和降低骨转换来介导对老年大鼠骨骼保护作用。

抗奥合剂通过p38 MAPK/NF-κB信号通路和ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解急性肺损伤研究

目的探讨抗奥合剂(KAHJ)治疗小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制,为其可能作为缓解新型冠状病毒(COVID-19)感染后症状的药物提供依据。方法采用网络药理学方法预测KAHJ治疗ALI的主要活性成分、潜在靶点和相关信号通路。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+KAHJ组。LPS+KAHJ组小鼠灌胃KAHJ(4.76 g·kg^(-1)·d^(-1),8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1)),其余组小鼠灌胃生理盐水(8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1))。14 d后,腹腔注射LPS(5 mg·kg^(-1))诱导ALI模型。收集小鼠血清和肺组织,通过组织病理学观察肺组织的病理变化。采用Western blot、qPCR、ELISA和IHC等方法评估KAHJ对ALI的改善作用。结果通过网络药理学筛选出疾病和药物共同的70个核心靶基因,并显示与多个信号通路密切相关,如MAPK、NF-κB、Apoptosis、COVID-19和肾素-血管紧张素系统(Ras)信号通路等。此外,通过实验验证发现KAHJ能改善小鼠ALI后的炎症和细胞凋亡,减少肺损伤和肺水肿,抑制肺纤维化。同时,KAHJ的作用机制与p38 MAPK和NF-κB的磷酸化以及ACE2/Ang1-7/Mas轴的调控也有着密切关系。结论KAHJ可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路和调控ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解ALI,为缓解COVID-19感染后症状提供了补充和替代药物。

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622通过激活ERK/p38 MAPK信号通路抑制Hela299细胞凋亡

目的探究沙眼衣原体Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应蛋白CT622对Hela299细胞凋亡的影响机制。方法设置不同质量浓度CT622蛋白刺激Hela299细胞,筛选最佳刺激质量浓度。将细胞实验分为PBS组(空白对照)、肿瘤坏死因子(TNF)-α组(阳性对照)、CT622组、CT622+TNF-α组、CT622+PD98059(ERK1/2抑制剂)组、CT622+SB203580(p38抑制剂)组、CT622+TNF-α+PD98059组、CT622+TNF-α+SB203580组。Hoechst33258染色和流式细胞术检测Hela299细胞的凋亡情况。Western blotting检测凋亡相关蛋白裂解的Caspase-3(cleaved-Casepase-3)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和凋亡信号通路中信号分子ERK/p38 MAPK蛋白的表达。结果5 mg/L CT622蛋白为Hela299细胞最佳刺激质量浓度。CT622蛋白显著抑制Hela299细胞的凋亡,并上调ERK1/2、p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达,下调Bax和Caspase-3蛋白表达。分别利用ERK1/2和p38 MAPK抑制剂与CT622联合处理可以明显增加Hela299细胞凋亡程度。结论T3SS效应蛋白CT622通过激活ERK/p38 MAPK信号通路抑制Hela299细胞凋亡。

PLA2G4C通过p38/MAPK信号通路介导线粒体自噬促进DLBCL进展的实验研究

目的研究磷脂酶A2ⅣC组(phospholipase A2 groupⅣC,PLA2G4C)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用及其可能调节机制。方法通过免疫印迹法(Western blot)检测PLA2G4C在DLBCL组织和细胞中的表达。构建PLA2G4C过表达或敲低表达的DLBCL细胞系,后用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或p38抑制剂SB203580处理细胞24h。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PLA2G4C转染效率;Western blot检测PLA2G4C蛋白、线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,MAP1 LC3Ⅱ/Ⅰ),Beclin1,p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],p38/丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)通路相关蛋白[磷酸化p38/MAPK(phosphorylated-p38/MAPK,p-p38/MAPK)]表达水平;CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。进一步构建异种移植瘤裸鼠模型,观察PLA2G4C对裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬的影响。结果DLBCL患者淋巴瘤组织中PLA2G4C蛋白表达显著高于反应性增生淋巴结组织(3.47±0.42 vs 1.01±0.02),差异具有统计学意义(t=-37.002,P<0.001);DLBCL细胞中PLA2G4C蛋白水平显著高于人淋巴母细胞样细胞系和B细胞淋巴瘤细胞系,差异具有统计学意义(F=73.771,P<0.001)。沉默PLA2G4C显著降低DLBCL细胞活力和侵袭能力,诱导细胞凋亡(t=6.909~11.390);过表达PLA2G4C后结果与之相反(t=2.392~19.778),差异具有统计学意义(均P<0.001)。且过表达PLA2G4C显著促进线粒体自噬的发生,而CQ或SB203580处理则可显著逆转PLA2G4C过表达对DLBCL细胞生物学行为及线粒体自噬的作用。体内裸鼠实验显示,敲低PLA2G4C显著抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=13.816~25.926,均P<0.001)。结论PLA2G4C在DLBCL中表达显著上调,可能通过促进p38/MAPK信号通路介导的线粒体自噬,促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,参与DLBCL的发生发展。

龙血素B通过P38MAPK信号通路调控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的机制

目的:探究龙血素B对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化和骨形成的影响以及其通过P38MAPK信号通路调控成骨分化和骨形成的机制。方法:培养MC3T3-E1细胞,加入不同浓度(0、15、30、60、90、120μmol/L)龙血素B,采用CCK8法和流式细胞术(FCM)检测不同时间(24h、48h、72h)MC3T3-E1细胞增殖能力和凋亡情况,确定龙血素B促MC3T3-E1细胞成骨最佳的药物浓度及作用时间。培养MC3T3-E1细胞并分为空白组(不作干预),龙血素B组(加入龙血素B共培养),龙血素B+阻断剂组(加入龙血素B和P38抑制剂SB203580共培养),进行干预实验;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组细胞ALP活性,qRT-PCR法检测各组细胞骨桥蛋白(OPN)基因、骨钙素(OCN)基因、骨唾液蛋白(BSP)基因表达水平,茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。结果:龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,效果与浓度和干预时间相关,在90μmol/L浓度下干预48h促MC3T3-E1细胞生长作用最强;干预结束后第1、3、5天,龙血素B组细胞ALP活性较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞ALP活性较龙血素B组降低(P<0.05);龙血素B组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较龙血素B组降低(P<0.05);干预结束后第21天,龙血素B组细胞钙化结节区域面积较空白组增大,龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组减小(P<0.05)。结论:龙血素B可提高MC3T3-E1细胞增殖活性,并通过激活P38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成。

黑逍遥散调控p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路对阿尔茨海默病大鼠神经炎症的影响

目的 观察黑逍遥散对Aβ_(1-42)所致阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力的影响,并从p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路介导的炎症级联反应探讨其作用机制。方法 双侧海马注射1μL Aβ_(1-42)溶液复刻AD大鼠模型。筛选造模成功的大鼠50只,随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组(0.5 mg/kg)和黑逍遥散低、中、高剂量组(4.25、8.5、17 g/kg),连续给药42 d。Morris水迷宫实验检测定位航行与空间探索能力,HE染色观察海马神经元病理结构改变,ELISA法检测海马组织Aβ_(1-42)、iNOS、PGE_(2)表达,RT-qPCR法检测海马组织p38、ATF2、COX-2 mRNA表达,Western blot法检测海马组织p-p38、p-ATF2、COX-2蛋白表达。结果 与模型组比较,黑逍遥散中、高剂量组和盐酸多奈哌齐组逃避潜伏期缩短(P<0.01),有效区域运动距离、目标象限滞留时间百分比增加(P<0.01),海马CA1区神经元排列有序,胞体清晰,凋亡细胞减少,海马组织Aβ_(1-42)、iNOS、PGE_(2)水平降低(P<0.05,P<0.01),p38、COX-2 mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),p38、p-p38、p-ATF2、COX-2蛋白表达降低(P<0.01)。结论 黑逍遥散可改善Aβ_(1-42)所致AD大鼠的认知能力,其机制可能与阻断p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路传导,进而减轻炎症反应有关。

四逆汤饼灸对兔膝骨关节炎软骨中Caveolin-1/p38 MAPK信号通路蛋白表达的影响

目的探讨四逆汤饼灸治疗膝骨关节炎(KOA)的作用机制。方法取新西兰兔50只,随机分为对照组、模型组、p38 MAPK抑制剂(抑制剂)组、四逆汤饼灸组、四逆汤饼灸联合p38 MAPK抑制剂(联合)组,每组10只。除对照组外,其他组采用右后肢膝关节伸直位石膏管型固定制备兔KOA模型。对照组、模型组不予治疗;抑制剂组于关节腔内注射p38 MAPK抑制剂TAK-715,1次/d,治疗2周;四逆汤饼灸组取鹤顶、内外膝眼穴位予以四逆汤饼灸治疗,1次/d,治疗2周;联合组于关节腔内注射p38 MAPK抑制剂TAK-715,并在鹤顶、内外膝眼穴位予以四逆汤饼灸治疗,1次/d,治疗2周。采用HE染色观察软骨病理变化,免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法(Western blot)检测软骨组织中Caveolin-1、p38 MAPK、MMP-13蛋白的表达。结果HE染色结果显示,模型组软骨表面明显粗糙,破坏严重,细胞排列紊乱,Mankin’s评分明显升高;抑制剂组、四逆汤饼灸组及联合组软骨表面较光滑,软骨细胞分布较均匀,Mankin’s评分降低。免疫组化与Western blot结果显示,与对照组比较,模型组软骨组织中Caveolin-1、p38 MAPK、MMP-13的表达均升高(P均<0.05);与模型组比较,抑制剂组、四逆汤饼灸组及联合组软骨组织中Caveolin-1、p38MAPK、MMP-13的表达均降低(P均<0.05)。结论四逆汤饼灸能延缓KOA软骨的进一步破坏,其机制可能与抑制Caveolin-1/p38 MAPK信号通路蛋白的表达有关。

基于TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路探讨心衰康胶囊对糖尿病大鼠心肌纤维化的改善作用

目的探究心衰康胶囊是否通过调控TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路改善糖尿病大鼠心肌纤维化。方法清洁SPF级雄性大鼠32只,随机分为对照组、模型组、心衰康胶囊组(1.0 g·kg^(-1)·d^(-1))、缬沙坦组(30 mg·kg^(-1)·d^(-1))。除对照组外,按30 mg/kg体质量腹腔注射浓度为1 mg/mL的链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型大鼠,对照组和模型组均0.9%氯化钠溶液灌胃。采用苏木素-伊红(HE)染色观察糖尿病大鼠心肌组织病理变化;免疫组织化学法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达水平;酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测大鼠TGF-β1、大鼠B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白水平;Western Blot法检测心肌组织中TGF-β1、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38抗体(p-p38MAPK)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)蛋白表达水平的变化。结果与对照组比较,模型组大鼠心肌排列紊乱,组织肿胀,有大量炎性细胞浸润,Bcl-2、p-CREB蛋白表达水平明显降低(P<0.01),TGF-β1、Caspase-3、p-p38 MAPK蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,心衰康胶囊组大鼠心肌纤维排列较整齐,炎性浸润减少,组织间隙无明显水肿,TGF-β1、p-p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05),p-CREB、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01)。结论心衰康胶囊可抑制糖尿病大鼠的心肌纤维化以及细胞凋亡,其改善作用可能与调控TGF-β1/p38MAPK/CREB信号通路有关。

比索洛尔通过ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路改善缺血再灌注诱导的H9C2心肌细胞损伤的研究

目的:探讨比索洛尔对缺血再灌注(I/R)诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,将H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、缺氧/复氧(H/R)模型组(Model组)、比索洛尔组(Bisoprolol组)、比索洛尔+凋亡信号调节激酶1(ASK1)重组蛋白组(Bisoprolol+ASK1组)。除Control组外,其余各组H9C2心肌细胞均进行H/R损伤处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测细胞活力;采用流失细胞术检测细胞凋亡;采用酶联免疫吸附试验检测细胞中心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)]和炎症因子[白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;采用激光共聚焦检测细胞中钙离子浓度;采用蛋白质印迹法检测细胞中ASK1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,Model组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Bisoprolol组和Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均升高,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Bisoprolol组比较,Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:比索洛尔能够通过抑制炎症反应和钙超载,改善I/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其作用机制可能与抑制ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路激活有关。

炎症微环境作用下P38 MAPK调控Wnt/Ca^(2+)信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响研究

目的探讨炎症微环境作用下P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)成骨分化和Wnt/Ca^(2+)信号通路的影响。方法将人PDLSC分为对照组、TNF-α组、TNF-α+SB203580组(20μmol/L SB20358)、TNF-α+SB203580+XAV939组(20μmol/L SB20358+10μmol/L XAV939),除对照组外其余各组细胞给予10 ng/mL TNF-α模拟炎症微环境。茜素红染色检测成骨分化能力,比较各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,RT-qPCR检测成骨关键基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Osterix(OSX)蛋白、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA水平,蛋白质印迹检测P38 MAPK、β-catenin、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)蛋白质表达。结果TNF-α组细胞的染色强度明显减弱且钙化结节的数量明显减少,TNF-α+SB203580组的染色强度、钙化结节数量较TNF-α组得到明显改善,TNF-α+SB203580+XAV939组细胞的染色强度、钙化结节数量与TNF-α+SB203580组差别不明显。与对照组比较,TNF-α组ALP活性和Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平降低(P<0.05),P38 MAPK蛋白质表达(P<0.05),β-catenin、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达降低(P<0.05)。与TNF-α组比较,TNF-α+SB203580组ALP活性和Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平升高(P<0.05),P38 MAPK蛋白表达质降低(P<0.05),β-catenin、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达升高(P<0.05)。与TNF-α+SB203580组,TNF-α+SB203580+XAV939组β-catenin蛋白质表达降低(P<0.05),但ALP活性、Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平和P38 MAPK、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达比较无统计差异(P>0.05)。结论炎症微环境下条件下P38 MAPK抑制剂可提高PDLSC成骨分化能力,可能与激活Wnt/Ca^(2+)信号通路有关。

基于ERK1/2和p38 MAPK信号通路探讨温阳化饮方对支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠的作用机制

目的探讨温阳化饮方对支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠的作用以及对ERK1/2和p38 MAPK信号通路的调节作用。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、对照组、实验组(n=15);先以卵蛋白(OVA)致敏刺激和雾化进行造模形成支气管哮喘模型大鼠,后以冰水喂养给以“饮冷”刺激,冰箱冷冻给以“形寒”刺激进行寒饮蕴肺证造模。实验组和对照组大鼠以剂量为30 mg/kg的温阳化饮方和雷帕霉素溶液(以医用生理盐水进行溶解)进行灌胃给药,正常组和模型组以等剂量的医用生理盐水灌胃,连续灌胃22 d。小微动物肺功能分析仪测定大鼠的肺功能;TUNEL检测肺组织中的细胞凋亡;ELISA法检测血清中细胞因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;Western blot检测肺组织中p-ERK1/2、p-p38 MAPK、凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达。结果与正常组相比,模型组大鼠吸气时的气道阻力(Rinsp)和呼气时的气道阻力(Rexp),血清中IL-6和TNF-α的含量,细胞凋亡率,p-ERK1/2、p-p38 MAPK、Bax的表达出现明显升高,肺胸通气时的动态顺应性(Cdyn)、Bcl-2的表达出现明显下降(均P<0.05),与模型组相比,对照组和实验组大鼠Rinsp和Rexp、血清中IL-6和TNF-α的含量,细胞凋亡率,p-ERK1/2、p-p38 MAPK、Bax的表达出现明显下降,Cdyn、Bcl-2出现明显升高(均P<0.05)。结论在支气管哮喘寒饮蕴肺证大鼠模型中,温阳化饮方能明显抑制炎性因子的释放,降低肺组织的细胞凋亡,这可能与抑制ERK1/2和p38MAPK信号有关。

ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

通过MAPK/ERK1/2信号通路探讨固本增骨方对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的探讨固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响及与MAPK/ERK1/2信号通路的关系。方法制备固本增骨方含药血清干预MC3T3-E1细胞,CCK-8法观察各组细胞增殖情况。ALP试剂盒、茜素红染色检测各组细胞成骨矿化能力。根据CCK-8检测、ALP活性检测与茜素红染色结果筛选最佳含药血清浓度及干预时间;将MC3T3-E1细胞分A、B、C、D 4组,分别加入空白血清、20%含药血清、空白血清+PD0325901、20%含药血清+PD0325901,采用RT-PCR检测各组细胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达水平,免疫印迹法Western blot检测各组细胞中ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组均能促进MC3T3-E1细胞增殖能力,提高ALP活性,其中20%含药血清干预48 h效果最为显著(P<0.05);茜素红染色后镜下观察在浓度为20%时染色区域钙结节数量最为密集;与A组相比,B组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平明显增高(P<0.05);加入阻断剂PD0325901后,C组与D组上述指标的表达明显降低(P<0.05);与D组相比,C组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平更低(P<0.05)。结论固本增骨方含药血清能促进MC3T3-E1细胞的增殖及矿化,并上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达,其作用机制可能与激活MAPK/ERK1/2通路有关。

LASS2/TMSG1过表达抑制人肺癌A549细胞增殖和促进A549细胞凋亡:基于上调神经酰胺和p38 MAPK进而启动级联信号传导通路

目的探究人源性长寿保障基因2/肿瘤转移抑制相关基因1(LASS2/TMSG1)过表达对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响并探讨相关机制。方法对课题组先前构建好的人肺癌A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组进行如下实验:Western blot检测LASS2/TMSG1蛋白表达水平,平板克隆形成实验、CCK-8法、Hoechst/PI双染、流式细胞术检测A549细胞体外增殖能力及凋亡情况。将14只裸鼠随机分为阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组,7只/组,分别向对应组别的裸鼠颈背部皮下注射A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1过表达组细胞悬液,构建裸鼠移植瘤模型,检测LASS2/TMSG1基因过表达对A549细胞体内增殖能力的影响。Western blot检测A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平。ELISA法分析A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK蛋白含量。结果与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组A549细胞LASS2/TMSG1蛋白表达量显著升高(P<0.05),体外增殖能力下降(P<0.05),早期凋亡率上升(P<0.05),移植瘤细胞体内增殖受到抑制(P<0.05),A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量均显著升高(P<0.05),A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK含量显著增加(P<0.05)。结论LASS2/TMSG1基因过表达能显著抑制人肺癌A549细胞的体内、外增殖能力,促进肿瘤细胞早期凋亡,这可能与LASS2/TMSG1基因过表达后上调了神经酰胺及其下游的效应分子p38 MAPK蛋白进而启动级联信号传导通路有关。

从“肺与大肠相表里”探究鼠李糖乳杆菌对过敏性哮喘小鼠ERK1/2和p38 MAPK通路的影响

目的基于“肺与大肠相表里”理论探讨鼠李糖乳杆菌对过敏性哮喘小鼠细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)通路及相关免疫细胞的影响。方法将18只雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、鼠李糖乳杆菌组,每组6只。采用卵白蛋白(OVA)致敏加激发方法构建小鼠过敏性哮喘模型,鼠李糖乳杆菌组于雾化激发前给予鼠李糖乳杆菌灌胃,连续7 d,对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。末次灌胃后取各组小鼠肺组织和结肠组织,HE染色进行组织病理观察;ELISA法检测血清OVA特异性IgE含量,流式细胞术检测肺组织中2型固有淋巴样细胞(ILC2)比例,Western blot法检测肺组织中p-ERK1/2和p-p38 MAPK表达情况。结果与对照组比较,模型组小鼠支气管及血管周围存在明显炎症细胞浸润,部分肺泡结构消失;结肠腺体排列紊乱,隐窝和杯状细胞明显减少,黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润;血清OVA特异性IgE含量、肺组织中ILC2比例、肺组织中p-ERK1/2及p-p38 MAPK相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,鼠李糖乳杆菌组小鼠支气管炎性细胞浸润明显改善;结肠腺体、杯状细胞增多,排列较为整齐,炎细胞浸润明显减少;血清OVA特异性IgE含量、肺组织中ILC2比例、肺组织中p-ERK1/2及p-p38 MAPK相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论鼠李糖乳杆菌可能通过抑制ERK1/2及p38 MAPK磷酸化,减少肺部ILC2,从而减轻过敏性哮喘的肺部炎症。

TPPU通过抑制p38 MAPK/NF-κB p65信号通路对阿尔茨海默病细胞模型的抗神经炎症作用

目的在Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)小胶质细胞(BV2细胞)模型中,采用对BV2细胞进行干预,探讨1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)脲(TPPU),TPPU是否具有抗神经炎症作用及其可能的抗炎机制。方法利用Aβ25-35作用BV2细胞构建AD细胞模型,CCK8法分别检测不同浓度Aβ25-35和TPPU处理对BV2细胞活性的影响,最终选择20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为造模组,0.1μM TPPU预处理BV2细胞3h,20μM Aβ25-35诱导BV2细胞48 h作为治疗组进行后续实验。利用ELISA法检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,倒置荧光显微镜检测活性氧(ROS)产生,real-time PCR检测小胶质细胞M1表型促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1β(IL-1β)基因mRNA表达水平和检测M2表型抗炎因子IL-10及标志物Arg1基因mRNA表达水平。通过Western blot法检测细胞中炎症因子TNF-α蛋白及p38 MAPK/NF-κB p65信号通路相关蛋白表达水平。结果与对照组相比,模型组BV2细胞活力降低(P<0.05),ROS显著升高(P<0.05),MDA含量显著增多(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显上调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显下调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组相比,经TPPU预处理后,BV2细胞活力明显升高(P<0.05),ROS显著降低(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05),SOD活性显著提高(P<0.05),TNF mRNA、IL-1βmRNA表达水平明显下调(P<0.05),IL-10 mRNA、Arg1 mRNA表达水平明显上调(P<0.05),TNF-α蛋白及p-p38 MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论TPPU抑制Aβ25-35诱导的BV2细胞炎症反应,促进BV2细胞由M1表型向M2表型极化,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB p65信号通路激活有关。

基于P38 MAPK/ERK自噬通路探讨五眼果水提物对草酸钙晶体致HKC细胞损伤的抑制作用

目的基于P38 MAPK/ERK通路探讨五眼果水提物抑制一水合草酸钙(COM)晶体致HKC细胞损伤的作用机制。方法将HKC细胞分为正常组、模型组和五眼果水提物高、中、低剂量组(160、80、40μg/mL),除正常组外其余各组用100μg/mL COM晶体构建HKC细胞损伤模型,药物组同时给予相应质量浓度药物。采用MTT法检测细胞存活率,微板法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和粘附在细胞表面钙离子(Ca^(2+))水平,自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)结合激光共聚焦显微镜检测自噬流,Western blot法检测细胞LC3B、Beclin1、P62、mTOR、p-mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、P38和p-P38蛋白表达。结果与模型组比较,五眼果水提物组细胞存活率升高(P<0.05),细胞上清液LDH活性和粘附在细胞表面Ca2+水平降低(P<0.05),细胞自噬体和自噬溶酶体形成减少(P<0.05),p-ERK1/2/ERK1/2、LC3BⅡ/LC3BⅠ和Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05),P62、p-P38/P38和p-mTOR/mTOR蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论五眼果水提物通过调控P38 MAPK/ERK信号通路抑制自噬,降低COM晶体与细胞的黏附性,从而减轻草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的损伤。

运动促进骨骼肌健康的新视角:基于Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的研究进展与展望

骨骼肌是维持机体运动能力、调节机体能量代谢的重要器官,其内分泌功能也日益被重视。久坐、衰老、肥胖等因素会引起肌萎缩,继而影响糖脂代谢稳态,引起内分泌失调等相关疾病。抑制Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路能干预癌变,而激活该通路可控制骨骼肌生成、调节机体糖代谢。通过文献资料调研法分析了Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路的生理基础以及运动对其影响的可能性,系统阐述了运动调控Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的潜在机制。研究认为,运动可通过Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路促进生肌决定因子的形成和葡萄糖转运蛋白4转位,从而促进骨骼肌再生,改善骨骼肌对葡萄糖的摄取能力。

搜风愈喘方基于ERK/p38MAPK信号通路对支气管哮喘模型大鼠气道炎症的作用机制探讨

目的探讨祛风、化痰、活血法并施的搜风愈喘方对哮喘大鼠气道炎症的作用机制以及对ERK/p38MAPK信号通路的调节作用。方法将32只SD大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组、搜风愈喘方组。先以卵蛋白(OVA)致敏及雾化激发制备哮喘大鼠模型。造模成功后,各组大鼠给予相应药物干预治疗21d。ELISA法检测血清及肺泡灌洗液(BALF)中的白细胞介素13(IL-13)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;HE染色、PAS染色观察大鼠肺组织病理形态学变化;RT-PCR法检测肺组织匀浆中IL-13、ERK1、ERK2、p38MAPK的mRNA表达;Western Blot法检测肺组织中ERK、p-ERK、p-38MAPK、p-p38MAPK的表达。结果ELISA法测定结果显示,与正常组比较,模型组血清中IL-13、TNF-α的含量升高(P<0.05),肺组织中IL-13、ERK1、ERK2、p38MAPK的mRNA表达及p-ERK、p-38MAPK的蛋白表达均明显增强(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组及搜风愈喘方组可降低血清中IL-13、TNF-α的含量、肺组织中IL-13、ERK1、ERK2、p38MAPK的m RNA表达及p-ERK、p-38MAPK蛋白表达(均P<0.05)。HE染色和PAS染色结果显示,与正常组比,模型组支气管黏膜固有层增厚,并伴以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润、杯状细胞增生及黏液分泌,肺组织病理评分明显上升(P<0.05);经搜风愈喘方干预后,上述病理变化明显减轻(P<0.05)。结论搜风愈喘方可减轻哮喘大鼠肺组织的炎症病变及炎症因子水平,并抑制ERK/p38MAPK信号通路。