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Small Amplicons Mutation Library for Vaccine Screening by Error-Prone Polymerase Chain Reaction
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作者 程曼曼 张云龙 +2 位作者 陈婷 张敏敏 陆昌瑞 《Journal of Donghua University(English Edition)》 CAS 2023年第2期171-176,共6页
Library construction is a common method used to screen target genes in molecular biology.Most library constructions are not suitable for a small DNA library(<100 base pair(bp))and low RNA library output.To maximize... Library construction is a common method used to screen target genes in molecular biology.Most library constructions are not suitable for a small DNA library(<100 base pair(bp))and low RNA library output.To maximize the library’s complexity,error-prone polymerase chain reaction(PCR)was used to increase the base mutation rate.After introducing the DNA fragments into the competent cell,the library complexity could reach 109.Library mutation rate increased exponentially with the dilution and amplification of error-prone PCR.The error-prone PCR conditions were optimized including deoxyribonucleotide triphosphate(dNTP)concentration,Mn^(2+)concentration,Mg^(2+)concentration,PCR cycle number,and primer length.Then,a RNA library with high complexity can be obtained by in vitro transcription to meet most molecular biological screening requirements,and can also be used for mRNA vaccine screening. 展开更多
关键词 error-prone polymerase chain reaction in vitro transcription DNA library RNA library
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Error-prone PCR获得EPSP酶突变基因提高水稻的草甘膦抗性 被引量:10
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作者 苏军 陈建民 +2 位作者 田大刚 朱祯 王锋 《分子植物育种》 CAS CSCD 2008年第5期830-836,共7页
将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进... 将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进行分子鉴定。对其中的3个株系进行农艺性状考察,并各选1个株系作为父本与其他优良恢复系进行杂交,进一步考察epsp和epsp102基因在不同遗传背景下的抗性和农艺性状表现。Southern结果显示:epsp的整合拷贝数为2~3拷贝,epsp102拷贝数为1~2拷贝。萌发种子、三叶期及分蘖期对草甘膦抗性检测显示:转基因萌发种子对草甘膦的抗性提高15倍;三叶期对草甘膦的抗性提高3~4倍。分蘖期剂量效应检测结果显示:非转基因对照在施0.1倍以上的致死剂量农达时,植株显著失水,而转基因株系水分生理正常。两地两季的农艺性状考察显示:与对照相比转基因株系的穗数明显增多,转基因株系ep-3和ep102-20结实率和单株重与对照没有显著差异;以ep-3和ep102-20作父本,与4个恢复系杂交的F2代对草甘膦的抗性没有降低,两个组合的结实率显著增加,SK/ep-3组合结实率显著下降,其余组合的结实率与对照持平。 展开更多
关键词 水稻 error-prone PCR EPSP酶突变基因 草甘膦
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Error-prone PCR致哈茨木霉几丁质酶突变的条件优化 被引量:2
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作者 王傲雪 李微 +1 位作者 陈秀玲 李景富 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期134-138,共5页
运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,... 运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,使用5.0 mmol·L-1Mg2+,0.5 mmol·L-1Mn2+,0.04 mmol·L-1dATP和dGTP,1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP进行扩增后,随机挑选10个克隆测序,累积13 370个碱基,检测到57个突变,平均突变率为0.4%。为产生优良突变株、酶分子定向进化奠定基础。 展开更多
关键词 Error—prone PCR 哈茨木霉几丁质酶 Chit42 突变
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Influence of Error-prone Channel on the Performance of IEEE 802.11 WLAN Utilizing RTS/CTS Handshaking 被引量:1
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作者 Haider M. AlSabbagh 陈建平 徐友云 《Journal of Shanghai Jiaotong university(Science)》 EI 2007年第6期799-804,共6页
A comprehensive study was presented for WLAN 802.11b using error-prone channel. It was theoretically and numerically evaluated the performance of three different network sizes with the bit rates that available in 802.... A comprehensive study was presented for WLAN 802.11b using error-prone channel. It was theoretically and numerically evaluated the performance of three different network sizes with the bit rates that available in 802.11b protocol. Results show that throughput does not change with the size of the network for wide range of bit error rates (BERs) and the channel bit rates play a significant role in the main characteristics of the network. A comprehensive explanation has given for the phenomenon of the packet delay suppression at relatively high level of BERs in view of the size of the networks and the BERs. The effect length of the transmitting packets is also investigated. 展开更多
关键词 IEEE802.11B REQUEST to send/clear to send(RTS/CTS) wireless local area network(WLAN) error-prone channel
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Influence of the Limited Retransmission on the Performance of WLANs Using Error-Prone Channel 被引量:1
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作者 Haider M. ALSABBAGH Jianping CHEN Youyun XU 《International Journal of Communications, Network and System Sciences》 2008年第1期49-54,共6页
In WLANs, stations sharing a common wireless channel are governed by IEEE 802.11 protocol. Many conscious studies have been conducted to utilize this precious medium efficiently. However, most of these studies have be... In WLANs, stations sharing a common wireless channel are governed by IEEE 802.11 protocol. Many conscious studies have been conducted to utilize this precious medium efficiently. However, most of these studies have been done either under assumption of idealistic channel condition or with unlimited retransmitting number. This paper is devoted to investigate influence of limited retransmissions and error level in the utilizing channel on the network throughput, probability of packet dropping and time to drop a packet. The results show that for networks using basic access mechanism the throughput is suppressed with increasing amount of errors in the transmitting channel over all the range of the retry limit. It is also quite sensitive to the size of the network. On the other side, the networks using four-way handshaking mechanism has a good immunity against the error over the available range of retry limits. Also the throughput is unchangeable with size of the network over the range of retransmission limits. However, the throughput does not change with retry limits when it exceeds the maximum number of the backoff stage in both DCF’s mechanisms. In both mechanisms the probability of dropping a packet is a decreasing function with number of retransmissions and the time to drop a packet in the queue of a station is a strong function to the number of retry limit, size of the network, the utilizing medium access mechanism and amount of errors in the channel. 展开更多
关键词 IEEE802.11 DCF WLAN MAC Protocol THROUGHPUT error-prone Channel.
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Polymerase-tautomeric Model for Untargeted Delayed Base Substitution Mutations Formation during Error-prone and SOS Replication of Double-stranded DNA Containing Thymine and Adenine in Some Rare Tautomeric Forms
6
作者 Helen A.Grebneva 《Journal of Oncology Research》 2019年第2期24-37,共14页
Polymerase-tautomeric model for untargeted delayed base substitution mutations is proposed.Structural analysis of bases insertion showed that any canonical bases may be inserted opposite rare tautomeric forms of thymi... Polymerase-tautomeric model for untargeted delayed base substitution mutations is proposed.Structural analysis of bases insertion showed that any canonical bases may be inserted opposite rare tautomeric forms of thymine T3*,adenines A2*and A4*so that between them hydrogen bonds are formed.Canonical adenine and cytosine can be incorporated opposite canonical thymine only.Canonical thymine and guanine can be incorporated opposite canonical adenine only.If in the synthesis of DNA containing rare tautomeric forms of thymine T3*,adenines A2*and A4*,involved DNA polymerases with relatively high fidelity of synthesis,mutations not appear.However,if further DNA synthesis will involve DNA polymerases having a low fidelity of synthesis,there may be base substitution mutations.It was shown that the conclusion made in the Tomasetti and Vogelstein cancer risk model that the formation of about 67%of all mutations was not caused by exposure to any mutagens is erroneous. 展开更多
关键词 Radiation-induced genomic instability Untargeted delayed base substitution MUTATIONS UV-mutagenesis Rare tautomeric forms of DNA bases Thymine adenine error-prone REPLICATION SOS REPLICATION
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Instrumental Variable Type Estimation for Generalized Varying Coefficient Models with Error-Prone Covariates 被引量:2
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作者 ZHAO Peixin 《Wuhan University Journal of Natural Sciences》 CAS 2013年第3期241-246,共6页
In this paper,the estimation for a class of generalized varying coefficient models with error-prone covariates is considered.By combining basis function approximations with some auxiliary variables,an instrumental var... In this paper,the estimation for a class of generalized varying coefficient models with error-prone covariates is considered.By combining basis function approximations with some auxiliary variables,an instrumental variable type estimation procedure is proposed.The asymptotic results of the estimator,such as the consistency and the weak convergence rate,are obtained.The proposed procedure can attenuate the effect of measurement errors and have proved workable for finite samples. 展开更多
关键词 generalized varying coefficient models instrumental variable error-prone covariates
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Saturation throughput analysis of RTS/CTS scheme in an error-prone WLAN channel 被引量:2
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作者 Xiang-yu PENG Le-tian JIANG Guo-zhi XU 《Journal of Zhejiang University-Science A(Applied Physics & Engineering)》 SCIE EI CAS CSCD 2009年第12期1714-1719,共6页
In this paper, a new three-dimensional Markov model is proposed for the estimation of saturation throughput of RTS/CTS (request to send/clear to send) scheme in an error-prone wireless local area network (WLAN) channe... In this paper, a new three-dimensional Markov model is proposed for the estimation of saturation throughput of RTS/CTS (request to send/clear to send) scheme in an error-prone wireless local area network (WLAN) channel. The model takes account of the effect of bit error on all the frames, and station short and long retry limits. Saturation throughput was re-analyzed using the new Markov model and numerical results closely matched those from simulation, confirming the accuracy of the new model. Evaluation of the influence of different parameters on throughput showed that the saturation throughput is sensitive to channel bit error rates and packet length, especially in high bit error conditions. 展开更多
关键词 饱和吞吐量 吞吐量分析 WLAN RTS 错误倾向 马尔可夫模型 CTS 信道
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ESTIMATION AND INFERENCE FOR VARYING-COEFFICIENT REGRESSION MODELS WITH ERROR-PRONE COVARIATES
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作者 XU Yongqing LI Xiaoli CHEN Gemai 《Journal of Systems Science & Complexity》 SCIE EI CSCD 2014年第6期1263-1285,共23页
This paper studies the estimation and inference for a class of varying-coefficient regression models with error-prone covariates.The authors focus on the situation where the covariates are unobserved,there are no repe... This paper studies the estimation and inference for a class of varying-coefficient regression models with error-prone covariates.The authors focus on the situation where the covariates are unobserved,there are no repeated measurements,and the covariance matrix of the measurement errors is unknown,but some auxiliary information is available.The authors propose an instrumental variable type local polynomial estimator for the unknown varying-coefficient functions,and show that the estimator achieves the optimal nonparametric convergence rate,is asymptotically normal,and avoids using undersmoothing to allow the bandwidths to be selected using data-driven methods.A simulation is carried out to study the finite sample performance of the proposed estimator,and a real date set is analyzed to illustrate the usefulness of the developed methodology. 展开更多
关键词 回归模型 估计器 变系数 协方差矩阵 局部多项式 测量误差 重复测量 辅助信息
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电子系统设计与实践课程线上线下混合式教学改革与实践
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作者 曹晓燕 梁斌 +1 位作者 李雷 周群 《实验科学与技术》 2023年第6期111-115,共5页
电子系统设计与实践是一门基础性综合设计实验,是电专业学生重要的实践环节。针对电子系统设计与实践课程线下教学存在的实验项目分立、学时紧张、不同能力学生对课时需求不同的问题,提出了建立实验示范性操作及易错知识库,升级考核方式... 电子系统设计与实践是一门基础性综合设计实验,是电专业学生重要的实践环节。针对电子系统设计与实践课程线下教学存在的实验项目分立、学时紧张、不同能力学生对课时需求不同的问题,提出了建立实验示范性操作及易错知识库,升级考核方式,线上教学与线下实践相结合的混合式教学体系。实践表明,相关措施在电子系统设计与实践课程教学中取得较好的效果,满足了不同能力学生的需求,对于提升学生创新实践能力有显著的效果,对于基础知识与专业知识的衔接发挥了重要作用。 展开更多
关键词 电子系统设计与实践 易错知识库 线上线下混合式教学 考核方式
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分子改造羰基还原酶CpCR提高其催化合成2-苯乙醇能力
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作者 陈孟军 吕育财 +1 位作者 龚大春 郭金玲 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第19期30-37,共8页
该研究对近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR进行分子改造,以提高其催化合成2-苯乙醇的能力。通过易错PCR构建突变文库,利用2,4-二硝基苯肼高通量筛选阳性突变株,测序确定氨基酸突变位点。再通过蛋白质半理性设计进行虚拟饱和突变,... 该研究对近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR进行分子改造,以提高其催化合成2-苯乙醇的能力。通过易错PCR构建突变文库,利用2,4-二硝基苯肼高通量筛选阳性突变株,测序确定氨基酸突变位点。再通过蛋白质半理性设计进行虚拟饱和突变,采用定点突变技术进行构建和评价。筛选获得突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性。进一步考察了催化时间、温度、pH值和底物浓度对wtCpCR和T171F催化合成2-苯乙醇的影响。研究表明,酶最适催化合成2-苯乙醇的温度为30℃;T171F最适催化合成2-苯乙醇的pH为6.5;苯乙醛的质量浓度为1000 mg/L时T171F产率可达91.24%,是wtCpCR的2.8倍。此外,突变体T171F相比wtCpCR催化时间由10 h降低到4 h,催化效率得到很大的提高。该研究为羰基还原酶催化合成2-苯乙醇提供科学基础,同时具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 羰基还原酶 易错PCR 2 4-二硝基苯肼 半理性设计 2-苯乙醇
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定向进化Rho1提高酿酒酵母的乙醇耐受性和超高浓度乙醇发酵性能
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作者 谭慧萍 王惠国 +4 位作者 赵增彤 程杨好 刘晨光 王亮 李倩 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2023年第2期10-20,共11页
燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止,生产强度严重降低,因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小GTP酶家族成员Rho1,构建易... 燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止,生产强度严重降低,因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小GTP酶家族成员Rho1,构建易错PCR产物文库,以酿酒酵母S288c为出发菌株采取“富集-自然生长-复筛”的筛选策略,成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株M2和M5。测序发现突变株过表达的Rho1序列出现了3~5个氨基酸的突变和大片段的缺失突变。以300 g/L起始葡萄糖进行乙醇发酵,72 h时,M2和M5的乙醇滴度比对照菌株分别提高了19.4%和22.3%,超高浓度乙醇发酵能力显著提高。本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点。 展开更多
关键词 酿酒酵母 乙醇胁迫 Rho GTP酶 易错PCR 超高浓度乙醇发酵
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易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性
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作者 郑婉 刘振杨 +2 位作者 郑金珠 武国干 吴华伟 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2023年第5期25-31,共7页
β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase),使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。... β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase),使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始β-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。 展开更多
关键词 Paenibacillus campinasensis β-CGTase 定向进化 易错PCR 酶学性质
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航天产品易错项目识别与控制的细化研究
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作者 厉晓笑 王宁 +2 位作者 张普光 马飞 贾文英 《质量与可靠性》 2023年第4期1-5,共5页
易错项目识别与控制是航天产品质量控制的重要手段之一,为进一步提高易错项目识别的有效性、规范性,开展了易错项目识别及控制的细化研究。首先明确了易错项目的定义;然后提出易错项目的分类建议,将其分为规格、位置、方向、顺序、材料... 易错项目识别与控制是航天产品质量控制的重要手段之一,为进一步提高易错项目识别的有效性、规范性,开展了易错项目识别及控制的细化研究。首先明确了易错项目的定义;然后提出易错项目的分类建议,将其分为规格、位置、方向、顺序、材料、选择、参数及状态8类;接着按类别建立了差错项目的识别线索,基于研制经验及历史案例,给出了与识别线索相关联的典型识别准则;最后细化了控制流程,明确了优先源头防差错设计的理念,并以总装阶段的管路阀门安装环节为对象开展了试应用,建立了典型易错项目清单。实践表明,该项研究可以为易错项目的识别与控制提供一定的理论支撑。 展开更多
关键词 易错项目 分类 识别线索 识别与控制流程 易错清单
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两种俯卧位固定方式在胰腺癌碳离子放疗中的摆位误差分析 被引量:1
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作者 步蕊蕊 查珊珊 +4 位作者 里尧 尤丹 周丹 孟露芳 李永强 《中国医疗设备》 2023年第7期73-79,102,共8页
目的 比较使用腹板俯卧位固定方式和使用体板、真空垫、体部定位膜三者相结合的个性化俯卧位固定方式在胰腺癌碳离子放疗中的摆位误差,为胰腺癌俯卧位放疗提供参考。方法 随机选取采用碳离子放疗的胰腺癌患者80例,其中采用腹板进行俯卧... 目的 比较使用腹板俯卧位固定方式和使用体板、真空垫、体部定位膜三者相结合的个性化俯卧位固定方式在胰腺癌碳离子放疗中的摆位误差,为胰腺癌俯卧位放疗提供参考。方法 随机选取采用碳离子放疗的胰腺癌患者80例,其中采用腹板进行俯卧位固定的患者40例(腹板组),采用体板、真空垫、体部定位膜三者相结合进行俯卧位固定的患者40例(真空垫组)。采用西门子kV级X线成像设备对每位患者采集正、侧位的正交野图像,与定位CT的DRR图像进行图像配准,获取六维方向(左右平移、头脚平移、前后平移、等中心旋转、俯仰旋转、横滚旋转)的摆位误差数据,并比较两组患者在六维方向的摆位误差。结果 真空垫组在左右平移、头脚平移、等中心旋转、俯仰旋转以及横滚旋转这5个方向上的摆位误差均明显小于腹板组,但在前后平移方向上的摆位误差大于腹板组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 在胰腺癌患者的碳离子放疗中,采用体板、真空垫、体部定位膜三者相结合的个性化俯卧位固定方式的摆位误差整体上优于采用腹板的俯卧位固定方式,在放疗前摆位时可以在扣好体部定位膜后不再移动患者前后方向,以减小前后平移方向上的误差,研究结果可为今后胰腺癌俯卧位的放疗提供参考依据。 展开更多
关键词 胰腺癌 碳离子放疗 固定方式 俯卧位 摆位误差
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草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟
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作者 郭小雷 《化学与生物工程》 CAS 2023年第7期34-39,44,共7页
以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发... 以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发酵培养发现,突变体S20C/E202R/N161S比野生型Eh-TPL的比酶活提高了30.61%;酶学性质研究结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的最适温度仍为37℃,最适pH值从8.2升至8.5,热稳定性、pH稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高Eh-TPL的催化效率,对酶法生产L-酪氨酸具有重要应用价值。 展开更多
关键词 易错PCR 定向进化 草生欧文氏菌 酪氨酸酚裂解酶 L-酪氨酸
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分子改良提高甘露聚糖酶的耐热性
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作者 王亚伟 薛强 熊海容 《湖北农业科学》 2023年第12期151-153,162,共4页
以来源于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的甘露聚糖酶基因(KJ806638)为研究对象,利用易错PCR方法对其进行改造,获得了耐热性进一步提高的甘露聚糖酶。筛选获得的N16I突变株,其最适反应温度从72.5℃提升到77.5℃。差示扫描荧光定量(DSF... 以来源于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的甘露聚糖酶基因(KJ806638)为研究对象,利用易错PCR方法对其进行改造,获得了耐热性进一步提高的甘露聚糖酶。筛选获得的N16I突变株,其最适反应温度从72.5℃提升到77.5℃。差示扫描荧光定量(DSF)检测结果显示,酶蛋白质的表观解链温度Tm从61.9℃提升到63.2℃。 展开更多
关键词 甘露聚糖酶 易错PCR 热稳定性
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基于易错PCR技术的短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶基因BpL的定向进化 被引量:21
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作者 黄瑛 蔡勇 +1 位作者 杨江科 闫云君 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期445-451,共7页
利用易错PCR技术对短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)YZ02脂肪酶基因BpL进行两轮定向进化研究,分别获得最佳突变株BpL1-7和BpL2-1369,其脂肪酶活力比出发酶分别提高了2倍和6倍。序列分析表明,突变体BpL2-1369有4个碱基发生了突变:T61C/C14... 利用易错PCR技术对短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)YZ02脂肪酶基因BpL进行两轮定向进化研究,分别获得最佳突变株BpL1-7和BpL2-1369,其脂肪酶活力比出发酶分别提高了2倍和6倍。序列分析表明,突变体BpL2-1369有4个碱基发生了突变:T61C/C147T/A334G/T371A,其中有3个碱基突变导致了氨基酸的改变。通过SWISS-MODEL数据库模拟脂肪酶的结构显示,3个突变氨基酸分别位于第1个α螺旋的第3个氨基酸、第4和第5个β折叠之间的转角以及第5个β折叠的第1个氨基酸位置。将野生型脂肪酶基因BpL和进化后的基因BpL2-1369的高效表达产物经Ni-Agarose柱和Sephadex-G75纯化后,酶学性质测定表明:突变脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍,Km值由8.24mmol/L降低至7.17mmol/L;在pH>8.0时的稳定性较野生型脂肪酶有所提高。 展开更多
关键词 短小芽胞杆菌 脂肪酶 定向进化 易错PCR
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定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力 被引量:11
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作者 赵博 陶进 +5 位作者 马吉胜 廉虹 王岩 常琳 高仁钧 曹淑桂 《催化学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第4期291-296,共6页
通过定向进化的方法,提高了一个新的源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶(BSL2)的活力.经过两轮易错PCR以及高通量筛选,最终获得了比活力为野生出发酶4.5倍的突变体3-1B2.基因比对结果表明,共有两个氨基酸发生了突变.突变酶的... 通过定向进化的方法,提高了一个新的源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶(BSL2)的活力.经过两轮易错PCR以及高通量筛选,最终获得了比活力为野生出发酶4.5倍的突变体3-1B2.基因比对结果表明,共有两个氨基酸发生了突变.突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性及pH稳定性略有增加,最适温度和最适pH值则无太大的变化.同源模建了BSL2与3-1B2的结构,并与底物进行了分子对接.结果表明,突变体3-1B2的结合能比野生型BSL2低1.29 kcal/mol,活性中心Ser77残基与底物羰基的距离也由0.319 nm减小为0.278 nm,因而加快了酶反应速度,提高了酶活力. 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 脂肪酶 易错聚合酶链反应 定向进化 分子对接
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D-泛解酸内酯水解酶的定向进化 被引量:8
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作者 柳志强 孙志浩 +2 位作者 郑璞 冷泳 钱嘉南 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期773-781,共9页
易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库... 易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体MutE861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH6.0和pH5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体MutE861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体MutE861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。 展开更多
关键词 串珠镰孢霉菌 D-泛解酸内酯水解酶 易错PCR DNA改组 筛选 定向进化
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