小鼠ES细胞条件培养基对绵羊类胚胎干细胞克隆、传代的影响

本研究以无血清培养基为基础培养液,旨在探求小鼠ES细胞条件培养液(ESCCM)和2种不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响。绵羊内细胞团从胚胎中分离得到后,分别以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)和绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)为饲养层进行培养。结果在MEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中可稳定传至第10代,而使用基础培养液最多传至5代。而在SEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中仅能传至3代。表明使用ESCCM和MEF能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆。对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且发现这些类ES细胞可以表达胚胎干细胞关键转录因子Nanog。结果表明,ESCCM可显著提高绵羊类ES细胞的分离克隆效率,原因可能是小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增殖的作用。且MEF比SEF更适合于绵羊类ES细胞的分离和传代。

饲养层对维持新建ES细胞系的影响

以ＳＴＯ细胞和鼠胚原代成纤维细胞（ＰＭＥＦ）为饲养层建立了１１个小鼠胚胎于细胞系（ＥＳ细胞系）。两种饲养层细胞都可以维持ＥＳ细胞的正常形态和体外分化能力，但ＳＴＯ细胞不能维持ＥＳ细胞的正常二倍体核型，ＰＭＥＦ的效果比ＳＴＯ为佳，但也仅能短期内维持二倍体状态，１０代后染色体数目逐渐发生偏离。分离出１０个ＥＳ细胞克隆。讨论了两种饲养层的不同和影响核型发生偏离的若干可能的原因。

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)建系和维持过程中的问题及对策

总结了十多年来我们从事ES细胞建系和培养工作的经验和教训 ,提出了研究工作中存在的问题以及解决这些问题的方法和对策 ,并对一些常规性的操作步骤进行了改进。同时 ,对某些尚不明确的问题进行了讨论 ,提出了我们的看法和建议。研究工作表明 ,我们采取的对策和方法是可行。

山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞

选择健康成年本地白山羊 ,自然发情、配种后 4 4 d取胎儿 ,以传统的原始生殖细胞 (PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞 (类 ES细胞 ) ,并对山羊类 ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明 ,采用传统方法和共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类 ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源 (山羊 )胎儿细胞饲养层上生长效果较好 ,可传 4代或 5代 ,而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类 ES细胞仅传 3代。另外 ,共培养不添加细胞因子组仅获 1个类 ES细胞集落 。

影响体外培养兔胚发育和兔类ES细胞分离的若干因素

本试验系统地比较了影响兔囊胚体外培养和免类ＥＳ细胞系分离的几个主要因素。结果表明，３种不同糖浓度（４．５，１．０，０．２ｇ／Ｌ）在４８ｈ内对胚胎贴壁均无显著影响。在高糖ＤＭＥＭ中，早期胚胎内细胞团（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ，ＩＣＭ）增殖速度最快，分化也快；超低糖组，ＩＣＭ增殖缓慢，分化出现时间较晚；低糖组，ＩＣＭ既能保持较快的增殖速度，又能维持较长时间的未分化状。高糖组和低糖组的ＥＳ细胞样集落的传代能力相似，可达６～７代，超低糖组中不超过２代。胰岛素能促进ＩＣＭ的增殖，并可提高传代过程中ＥＳ细胞样克隆的形成率。在小鼠胚胎原代成纤维细胞（ＭＥＦ）和一种经白血病抑制因子转化了的小鼠成纤维细胞系（ＳＮＬ）上，ＩＣＭ都能维持较快的增殖速度，在家兔胚胎原代成纤维细胞（ＲＥＦ）中ＩＣＭ增殖较慢，无饲养细胞条件下，ＩＣＭ存活率低，生长状况不佳。传代能力，ＲＥＦ要比ＭＥＦ和ＳＮＬ低，且主要形成上皮样集落。作者根据以上实验结果认为，用低糖ＤＭＥＭ为基本培养基，再加入胰岛素，在ＭＥＦ或ＳＮＬ上培养切割胚胎和连续传代的技术路线是较为可行的。

大鼠心肌条件培养基对形成小鼠ES细胞集落的影响

报道一种新的从小鼠囊胚中培养和分离出ＥＳ细胞集落的方法。取出生２～３周龄大鼠的心肌组织制备单层培养物，收集６代以内的条件培养基（ＲＨＣＭ）。以ＲＨＣＭ培养Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的囊胚（无饲养层），对照组以小鼠胚胎原代成纤维细胞（ＭＥ）为饲养层，并补加ＬＩＦ因子。经过１９０个胚的实验证明，以ＲＨＣＭ为培养基培养小鼠囊胚时，胚胎贴壁率、ＩＣＭ增殖率和ＥＳ细胞集落的出现率与对照组没有显著性差异，分别为６７％、９３％和１３％。这种新的方法为简便而有效地建立与培养小鼠ＥＳ细胞系提供了有益的资料。

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后 6～ 8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚 ,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞 (PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后 ,将各自一半胚胎切割 ,把含 ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养 ,另一半整胚在各自饲养层上继续培养 ,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当 ICM增殖一定程度时进行传代 ,以比较其类 ES细胞分离与克隆的效果。结果表明 ,在 2种不同饲养层上 ,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚 ,囊胚的脱带率均高于桑椹胚 ,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在 PMEF还是在 PGEF饲养层上 ,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚 ,而贴壁率高于脱带整胚 ,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在 PMEF饲养层上所获类 ES细胞只能维持 3代 ,而在PGEF饲养层上 ,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类 ES细胞传至 5代。由此认为 ,对脱带后的胚胎进行切割处理 ,有利于 ICM的贴壁和增殖 ;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统 ,有利于类

小鼠ES细胞种系嵌合体的获得

种系嵌合体的获得是实现ＥＳ细胞介导的转基因途径的决定步骤。ＥＳ细胞种系分化能力的保持是决定种系嵌合的前提条件，而嵌合体的制作及种系嵌合体的获得则是判定ＥＳ细胞系是否具有种系分化能力的唯一方法。为考察本室新近建立的３种小鼠ＥＳ细胞系ＭＥＳＰＵ２１、ＭＥＳＰＵ２２和ＭＥＳＰＵ２９的种系分化能力，选用近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及远交系ＫＭＷ和ＩＣＲ为受体胚胎提供者，分别通过囊胚注射法和８细胞期桑椹胚注射法进行了嵌合体构建实验。共获得嵌合体８１只，经毛色分析确定在进行测交的４２只嵌合体中有１９只是种系传递者，为国内小鼠ＥＳ细胞种系嵌合体的首例报道。在所考察的３种ＥＳ细胞系中，ＭＥＳＰＵ２ｌ和ＭＥＳＰＵ２２均能以较高效率获得种系嵌合体，并且多数种系嵌合体（１４／１９）可高效传递ＥＳ细胞来源的毛色性状，确凿证明两细胞系均具有较强的种系分化能力，可作为优良的细胞载体介导小鼠基因组进行的基因改造。

ES细胞（MESPU13）嵌合体小鼠的GPI分析

为了评判小鼠ＥＳ细胞系ＭＥＳＰＵ１３的分化潜能，我们对１９只嵌合小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胰腺、生殖腺、肌肉和血液的ＧＰＩ（磷酸葡萄糖异构酶）进行了分析。在这些样品中，来源于ＥＳ细胞的Ａ型条带的检出情况和小鼠的毛色嵌合率成正比关系。当毛色嵌合率低于４０％时，除了少数小鼠的肾脏外，没有看到Ａ型的条带。当毛色嵌合率大于８５％时，几乎所有的器官组织都检测到Ａ型条带，显示了ＥＳ细胞在发育形成内、中、外胚层的细胞方面具有很高的分化潜能。另外，在毛色嵌合率大于８５％的其中的６只嵌合鼠的肌肉中，只观察到Ａ型的条带，表明这些肌肉只单独来源于ＥＳ细胞。

大鼠心脏细胞条件培养基对小鼠ES细胞特性的维持

以C1 9- 2和MESPU - 1 3为供试细胞 ,用克隆测试、传代培养等方法对 1 7种细胞的条件培养基进行了筛选 ,结果表明 ,大鼠心脏细胞的条件培养基 (RH -CM)具有显著抑制小鼠ES细胞分化、维持其二倍体核型、促进ES细胞贴壁生长的作用。经RH -CM培养 1 0代和 2 0代的小鼠ES细胞在体内外分化能力上仍保留了原ES细胞的多方向分化潜能和特征 ;RH -CM也可作为小鼠ES细胞培养基的添加物 ,用含 70 %RH -CM的ES细胞培养基和小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层 (PMEF)培养ES细胞 ,可长期有效地维持其未分化状态和二倍体核型。RT

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到

两个可进入种系的ES细胞系的建立

从129／ter小鼠中建立了9个ES细胞系，它们在核型、生长速度、体内外分化能力等方面显示了各自不同的特点。通过囊胚显微注射法，将ES细胞注入C57BL／6J胚胎中，制作了嵌合体，并通过对嵌合体后代毛色的观察，判断了嵌合体生殖细胞的组成。结果表明，ES细胞系MESPU21、MESPU22都具有很强的种系嵌合能力。比较这两个细胞系与其他细胞系，证明一个好的ES细胞系必须具备核型正常、生长速度快、体外分化速度适中的特点。建系过程中精心的操作有利于获得好的ES细胞系。ES细胞体内分化形成的肿瘤的组织成分可能与嵌合体制作的结果间存在一定的相关关系。

牛体细胞克隆胚胎类ES细胞集落的筛选及其核移植

对第 7d的牛体细胞克隆囊胚进行体外增殖培养 ,分离筛选类ES细胞 ,并对其进行了传代培养。接种在饲养层上的体细胞克隆囊胚细胞 ,在传代的 2 4h内增殖形成小集落 ,2～ 3d有雀巢状的集落出现 ,筛选形态相同的细胞集落进行传代培养 ,4～ 5代后 ,皿底出现多个大小不等的多细胞单层集落。将传 4～ 5代的细胞集落接种到无饲养层的 4孔培养皿中培养 ,2 4h出现多细胞单层集落 ,4～ 7d长满皿底 ,并形成上皮样细胞 ,呈网状 ,将其作为核供体细胞进行核移植实验。结果有 80 % (40 5 0 )核 质融合的移核重构胚发生卵裂 ,5 % (2 4 0 )发育至桑椹胚期 ,2 5 % (1 4 0 )发育至囊胚期 ,92 5 % (37 4 0 )停止在 2～ 4细胞期。结果表明 :采用牛体细胞克隆胚胎的类ES细胞进行核移植 。

具高效种系嵌合能力的C57BL/6J小鼠ES细胞系的建立

采用小鼠原代成纤维细胞作为饲养层，在含1×103单位白血病抑制因子（LIF）的DMEM高糖培养基中，建成了11个C57BL／6J小鼠的ES细胞系，成系率为9．6％。所建的11个ES细胞系中有5个核型正常率大于70％。这些细胞具早期胚胎细胞的特征，呈碱性磷酸酶阳性，具表达0014基因的特性5进行体内分化实验时能发生广泛的分化。通过嵌合体制作实验证明其中3个系具嵌合能力，并从中筛选出具高效种系嵌合能力的MESPU35细胞系，MESPU35细胞的克隆能达到种系传递，经过基因操作的细胞克隆，也保留了高效的嵌合能力。因此，MESPU35细胞可作为制作突变小鼠的有效载体。

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构成皮肤类似物的分化

【目的】以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞构建皮肤类似物,探讨其在皮下的分化潜能。【方法】Hoechst33342标记E14-ES细胞,经羊膜诱导4d后,形成表皮干细胞克隆,并以其作为种子细胞,取129胎鼠成纤维细胞与复合凝胶-明胶海绵复合,形成皮肤类似物,埋植于129小鼠皮下组织。术后2周、4周、6周、8周取材,做HE染色观察,β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫组化荧光双标和免疫组化观察。【结果】术后2周和4周,植块内可见单层立方或柱状上皮构成的管状和泡状结构,6周和8周后,可见角化复层上皮、毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,免疫双标结果显示,植入2周和4周,带有蓝色核标记的细胞形成的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18阳性,6周和8周后,HE染色中汗腺样结构呈CEA、CK18阳性。【结论】ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建的皮肤类似物,在同种小鼠皮下有分为角化复层上皮、汗腺样、毛囊样、皮脂腺样等结构的潜能。

由体外受精囊胚获得ICR小鼠ES细胞

收集鼠卵母细胞和精子 ,采用体外受精技术 ,获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚 ,分离内细胞团 ,获得 ICR小鼠的 ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的 ICR小鼠 ES细胞 ,而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常规方法 ,且比较稳定。ICR小鼠 ES细胞的获得 ,为研究小鼠的 ES细胞分化提供了条件。

用大鼠心肌条件培养基建立来源于C57BL/6J小鼠的ES细胞系

报道一种新的建立C57BL/ 6J小鼠ES细胞系的方法。采用大鼠心肌条件培养基 ,在不使用饲养层细胞和白血病抑制因子 (LIF)的情况下 ,从C57BL/ 6J品系小鼠中建成 1个ES细胞系即MESPU 4 1,成系率为 1 0 %。MESPU 4 1细胞为XX型 ,核型正常率高达 89% ,表现出XX型ES细胞系少有的稳定性。进行体内分化实验时MESPU 4 1细胞能发生广泛分化形成畸胎瘤。嵌合体制作实验证实MESPU 4 1细胞具有嵌合能力 ,能参与胚胎的发育。采用RT PCR方法 ,检测出大鼠心肌细胞有LIFmRNA的表达 ,这可能与其条件培养基保持ES细胞未分化状态并使X染色体稳定有关。同时 ,还对大鼠心肌细胞进行了永生化的尝试 ,共得到了 4个永生化克隆 ,这将进一步简化ES细胞建系和培养工作 ,为进一步研究ES细胞在体外培养过程中的稳定性开创了新的起点。

C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系的建株(英文)

目的:建立C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。方法:收集3.5d.p.c.的囊胚,培养在预先铺有小鼠成纤维细胞(MEFs)的高糖DMEM培养液中。3-4d后,挑出内细胞团(ICM),消化后重新种到新鲜的有MEFS培养液中。等到有典型的ES样集落长出,即传代以得到永久ES细胞系。通过分析碱性磷酸酶活性,SSEA-1,Oct-4的表达和形成畸胎瘤的能力来鉴定ES细胞的多向分化能力。结果:获得的两个C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系绝大多数细胞具有正常的核型(40,XY),碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1,Oct-4表达阳性,ES细胞注入SCID鼠后可获得来自3个胚层的组织。结论:建立了两株具有长期自我更新能力和多向分化潜能的C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。

研究哺乳动物早期胚胎发育与分化的ES细胞途径

ＥＳ细胞即胚胎干细胞，它是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞体外分离培养而建立的。其特点是只生长，不分化，并保持发育的多能性。作为一种理想的模型系统与有用的工具，可用于研究哺乳动物早期胚胎的发育与基因的表达。本文从以下四个方面分述了ＥＳ细胞的具体应用及其研究进展：１）探讨早期胚胎生长发育的条件；２）研究胚胎组织分化的发生及其诱导；３）用ＥＳ细胞与正常胚胎细胞在体外重建胚胎；４）ＥＳ细胞体外定位整合外源ＤＮＡ。

FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的 构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法 在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果 将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论 FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。