参麦注射液对COPD合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响

目的探讨参麦注射液对慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响。方法选取本院呼吸科收治的COPD合并肺结核患者158例,按随机数字表法分组,对照组79例予以常规治疗,研究组79例在对照组基础上予以参麦注射液治疗,观察并记录2组间血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平、细胞因子水平、外周血免疫细胞水平,同时比较临床疗效及病灶吸收有效率。结果对照组临床总有效率（84.81%）低于研究组临床总有效率（94.94%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;对照组病灶吸收有效率（87.33%）低于研究组病灶吸收有效率（96.21%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;与对照组比较,研究组治疗后血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平较低,治疗后血清TNF-α、IL-6、s IL-2R水平较低,治疗后外周血NK细胞、CD4~＋T淋巴细胞及CD4~＋/CD8~＋水平较高,CD8~＋T淋巴细胞水平较低,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论参麦注射液能够明显降低COPD合并肺结核患者血清TNF-α、IL-6、s IL-2R及ESAT-6/CFP-10水平,改善细胞免疫功能,有效促进病灶吸收,提高临床疗效。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值

目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验,检测斑点形成细胞数。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85.7%(60/70)、77.1%(54/70)、72.9%(51/70),特异性依次为82.4%(28/34)、85.3%(29/34)、88.2%(30/34)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c ELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值

目的:评估结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取肺结核病患者78例,非结核性肺部疾病患者27例和健康体检者39例,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs),采用酶联免疫斑点试验检测斑点形成细胞数,判断肺结核感染情况。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的敏感性依次为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78),特异性依次为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c有较高的敏感性和特异性,对活动性肺结核的辅助诊断有一定的临床应用价值。

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达

目的:探究结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达。方法:收集经病理学诊断的19例石蜡包埋肺结核组织标本,以20例正常肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)为阴性对照,采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10,并与抗酸染色进行对比。结果:ESAT-6及CFP-10的阳性信号主要分布在结核病灶的坏死区域及其周围的巨噬细胞和多核巨细胞中,其分布与抗酸杆菌有关,范围更广。免疫组化检测ESAT-6的敏感度、特异度分别为73.68%、90.00%;CFP-10的敏感度和特异度分别为63.16%和95.00%;抗酸染色敏感度为52.63%,免疫组化的敏感度高于抗酸染色(P<0.05)。结论:采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10在结核诊断中有潜在的应用价值。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白的抗原性分析及其对诊断结核临床应用价值

目的分析ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为结核抗原的特性,并探讨以其作为抗原的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在结核诊断中的应用价值。方法以ESAT-6/CFP-10融合蛋白为刺激抗原的ELISPOT法(ESAT-6/CFP-10-ELISPOT)检测经结核特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞数量方法,测定65例单纯结核病患者,16例HIV/结核双重感染患者,20例HIV感染患者,32例非结核呼吸道疾病患者,30名健康体检者外周血单个核细胞中结核菌抗原特异的T淋巴细胞的频率。结果 ESAT-6/CFP-10-ELISPOT与结核菌素皮肤试验(TST)在所有81例结核患者中的比较,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT阳性率98.8%,TST阳性率为56.8%;ESAT-6/CFP-10-ELISPOT在涂阳结核组、涂阴结核组、HIV/结核双重感染组阳性率分别为100.0%、97.1%、100.0%,其敏感性远高于痰涂片检查,且各组结果差异无统计学意义;20例HIV感染组有1例阳性,非结核呼吸道疾病患者组与健康对照组均为阴性,提示ESAT-6/CFP-10-ELISPOT方法的特异度为98.8%。结论ESAT-6/CFP-10融合蛋白可以很好的刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素,适合作为结核诊断中的特异性抗原,因而可以用于ELISPOT的检测,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT对结核诊断有应用价值。

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。

早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6

目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值。方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6。结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%。结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法。

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和

结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔,收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示,成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒,获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白,以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。

CFP-10/ESAT-6特异性IFN-g释放反应诊断活动性肺结核的研究

前期研究已经建立了基于结核分枝杆菌特异性抗原CFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激外周血单核细胞IFN-γ释放反应,本研究旨在证实该方法在活动性肺结核及结核菌潜伏感染诊断中的意义。实验对象包括111例当地医院收治的活动性肺结核病人(病例组)及283例某大学入学新生(健康对照者)。采集肝素抗凝血,分别加入含结核菌抗原CFP-10/ESAT-6、植物血凝素及无刺激物(PBS)的细胞培养孔中,培养过夜,次日收集血清,进行IFN-γ检测。同时,对其中58位病人志愿者及46位健康对照志愿者进行了结核菌素(PPD)皮内变态反应。病例组与健康对照组的PPD皮内变态反应阳性率分别为79.3%(46/58)和76.1%(35/46),无显著差异(P>0.05),表明PPD皮内变态反应不能用于活动性肺结核的检测。病例组IFN-γ体外释放反应的阳性率为95.5%(106/111),而健康对照组阳性率为16.3%(46/283),两组间均存在极显著差异,表明IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度(95.5%)与良好的特异性。在健康组中,IFN-γ体外释放反应与PPD皮内变态反应的总符合率为50.0%,且IFN-g体外释放反应阳性者中,83.3%为PPD皮内变态反应阳性;在病例组中,二者的总符合率为72. 4%,IFN-g体外释放反应阳性者中,77.8%为PPD皮内变态反应阳性。CFP-10/ESAT-6特异性IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度与特异性,PPD皮内变态反应由于受卡介苗免疫等因素影响在我国不能用于诊断活动性肺结核病与结核菌感染。

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

检测结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6分泌蛋白双抗体夹心ELISA的建立

用重组蛋白CFP10-ESAT-6免疫新西兰大白兔,通过ELISA方法检测抗体效价水平;高效价抗体用DEAE-32阴离子交换柱纯化后,一部分抗体为包被所用,另一部分抗体用辣根过氧化物酶标记后,作为检测用,建立双抗体夹心法,进行了初步鉴定,确定该方法的可行性。结果表明:抗CFP10-ESAT-6多克隆抗体的效价在1∶16000稀释后D450值基本都达到1.0左右,在纯化、酶标记后,分别以1∶5000为包被工作浓度,1∶3000为酶标工作浓度时,能较高特异性检测结核杆菌培养上清分泌的CFP10-ESAT-6抗原。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白诊断结核性感染和结核病的研究

目的::探讨ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)释放IFN-γ反应及其对结核性感染和结核病的诊断价值。方法:选取健康对照组(34例),密切接触组(19例)和结核病组(39例)3组对象,按其有无卡介苗(BCG)接种各分成两个2组共6小组:健康对照组BCG未接种者(15例)、健康对照组BCG接种者(19例)、密切接触组BCG未接种者(6例)、密切接触组BCG接种者(13例)、结核病组BCG未接种者(7例)和结核病组BCG接种者(32例)。分离PBMC并分别与PPD和ESAT-6/CFP-10融合蛋白共同培养5d,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清液中IFN-γ,观察6组对象IFN-γ释放反应。结果:PPD刺激后,健康对照组BCG未接种者与密切接触组BCG未接种者结果之间差异有统计学意义(P<0.01),而3组BCG接种者之间结果差异无统计学意义(P>0.05)。ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激后,健康对照组、密切接触组、和结核病组3组总阳性率分别为0%,21.1%,87.2%,阳性率明显增加。健康对照组BCG未接种者与密切接触组BCG未接种者结果之间差异有统计学意义(P<0.05);健康对照组BCG接种者与密切接触组BCG接种者结果之间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:ESAT-6/CFP-10融合蛋白为结核杆菌特异性抗原,能够区分BCG接种和结核病,在结核性感染和结核病的诊断中有应用价值。

和厚朴酚抑制CFP-10、ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症因子表达

目的 研究和厚朴酚（HNK）对早期分泌抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）作为特异性抗原刺激人肺泡Ⅱ型上皮细胞（A549）炎症因子表达的抑制作用,探讨抗炎在结核病治疗中的潜在价值.方法 用MTS法检测HNK（0～80μmol/L）对A549细胞的毒性反应,确定合适的药物实验浓度.用ELISA法检测以CFP-10、ESAT-6（0～40μg/ml）为抗原刺激的A549表达IL-8水平,选择最适刺激浓度.将A549细胞与CFP-10,ESAT-6及不同浓度的HNK（0～20μmol/L）共同培养24h后收集培养上清液和细胞,用ELISA法检测各组培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的表达水平,分析HNK对细胞因子的剂量依赖抑制.结果 20μmol/L及以下的HNK浓度对A549细胞无明显毒性反应.抗原最适刺激浓度为5μmol/L.CFP-10,ESAT-6刺激可显著诱导A549细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及Rantes的产生.HNK（0～20μmol/L）剂量依赖性地抑制CFP-10,ESAT-6诱导的炎症因子的表达.结论 HNK能有效抑制CFP-10,ESAT-6诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的表达.

Rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达

根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。

ESAT-6及CFP-10刺激颗粒酶B在儿童结核诊断中的价值

目的探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(GrB)水平对儿童活动性结核(ATB)的诊断价值。方法选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATB 26例、结核潜伏感染(LTBI)20例、非结核病对照(Non-TB)20例,健康对照(HC)20例],ELISA检测ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后GrB水平,流式细胞术检测表达GrB和干扰素-γ(IFN-γ)的CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例。结果ESAT-6/CFP-10刺激后结核组特异性GrB较对照组显著升高(P<0.001),且LTBI组显著高于ATB组(P<0.001)。CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞均可分泌GrB。结论结核特异性GrB对儿童活动性结核的鉴别诊断可能具有重要价值。