结核分枝杆菌分泌蛋白早期分泌性抗原6(ESAT-6)的免疫学性质及其在新型疫苗中作用的研究进展

早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进MTB的扩散、定植,引发MTB的全身感染。ESAT-6还可抑制Th1细胞的保护性免疫反应从而抑制相关促炎细胞因子的分泌,引发机体免疫功能的紊乱,加速MTB感染进程。在这一感染过程中,ESAT-6所具备的高度免疫原性使其可作为优势抗原用于新型结核病(TB)疫苗的研制,具有广阔的发展前景。

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。

SPP1、DEC1、C1QTNF6蛋白与口腔鳞状细胞癌患者临床病理指标及预后的关系

目的:探讨口腔鳞状细胞癌患者血清重组人分泌型磷蛋白1(SPP1)、软骨分化的表达基因1(DEC1)和补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(C1QTNF6)的表达水平与其临床病理指标及预后的关系。方法:免疫组织化学染色法和电化学发光免疫分析法检测88例口腔鳞状细胞癌患者癌组织和血清中SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白的表达水平;Pearson相关性分析和Kaplan-Meier生存分析法分析患者血清SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白表达水平与其临床病理指标的相关性和对患者预后的影响。多因素Cox回归法分析影响口腔鳞状细胞癌患者预后的危险因素。结果:免疫组织化学染色结果显示口腔鳞状细胞癌患者癌组织中SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白的阳性表达率较癌旁组织分别增加了1.94、2.98和2.35倍(P<0.05或P<0.01);电化学发光免疫分析法结果显示口腔鳞状细胞癌患者血清SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白表达水平较正常人分别上调了8.61、6.20和4.03倍(P<0.05或P<0.01);Pearson相关性分析结果显示患者血清SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白表达水平与患者发生多灶嗜神经侵犯、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、较高的TNM分期呈正相关(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析结果显示,血清SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白高表达水平的口腔鳞状细胞癌患者总生存率低;多因素Cox回归分析结果表明多灶嗜神经侵犯、肿瘤高浸润度、淋巴结转移和高的TNM分期是影响预后的危险因素(P<0.05)。结论:口腔鳞状细胞癌患者癌组织和血清中SPP1、DEC1和C1QTNF6蛋白表达水平升高,且与患者发生多灶嗜神经侵犯、肿瘤浸润和淋巴结转移、较高的TNM分期呈正相关,而与患者预后呈负相关。

结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6家族的研究进展

ESAT-6家族蛋白是结核分枝杆菌早期分泌蛋白中具有较强免疫原性的成分之一,卡介苗中缺乏该家族的一些重要成分。近年对其分布、结构、免疫学特征以及生物学用途方面的研究较多,该蛋白在作抗结核分枝杆菌亚单位疫苗的候选抗原、DNA疫苗的候选基因以及作为结核分枝杆菌感染的免疫学诊断试剂等领域体现出良好的研究及应用前景。

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用 6kDa早期分泌性抗原靶蛋白 (ESAT - 6 )基因构建真核表达重组质粒pcDNA3 1(+) -ESAT - 6 ,并鉴定其在真核细胞 (COS - 7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体pUCm -T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR反应产物克隆于真核表达载体 pcDNA3 1(+)上。并用脂质体介导真核表达重组质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT - 6转染真核细胞COS - 7,72h后 ,通过SDS -PAGE和免疫印迹鉴定ESAT - 6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT - 6构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1(+) -ESAT-成功 ,通过SDS -PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量 6kDa的特异蛋白 ,免疫印迹证明该 6kDa蛋白能与抗ESAT - 6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒成功构建 ,该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6。

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( +)中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果 重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论 结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的 构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。 方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a(+ ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。 结果 从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。 结论 利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。

内镜黏膜下剥离术治疗胃肠神经内分泌肿瘤的效果及对血清IL-6、CgA的影响

目的分析内镜黏膜下剥离术(ESD)治疗胃肠神经内分泌肿瘤(GI-NENs)的效果,并探讨其对患者血清白介素-6(IL-6)、嗜铬粒蛋白A(CgA)的影响。方法回顾性分析2017年1月至2018年10月期间榆林市第一医院消化内科收治的85例GI-NENs患者的临床资料,按照手术方式不同分为EDS组41例和EMR组44例,ESD组患者给予ESD治疗,EMR组患者给予内镜下黏膜切除术(EMR)治疗。比较两组患者手术相关指标、病变切除情况,检测并比较两组患者手术前、手术后1周的血清IL-6、CgA水平,记录两组患者手术并发症发生情况,随访3年,统计两组患者病灶残留和复发情况。结果ESD组患者的手术时间、住院时间分别为(39.01±4.74)min、(6.72±1.12)d,明显长于EMR组的(14.85±2.35)min、(5.46±0.79)d,手术费用为(1.02±0.15)万元,明显多于EMR组的(0.31±0.06)万元,差异均有统计学意义(P<0.05);ESD组切除病灶大小为(1.85±0.42)cm,明显大于EMR组的(1.34±0.27)cm,病灶整块切除率、完全切除率分别为92.68%、85.37%,明显高于EMR组的65.91%、61.36%,差异均有统计学意义(P<0.05);ESD组术后迟发性出血、穿孔以及皮下气肿或气腹手术并发症发生率分别为4.88%、9.76%、7.32%,与EMR组的2.27%、0、2.27%比较差异无统计学意义(P>0.05),ESD组并发症总发生率为21.95%,明显高于EMR组的4.55%,差异有统计学意义(P<0.05);手术后,ESD组血清IL-6、CgA水平分别为(6.13±0.89)ng/L、(54.72±6.01)μg/L,明显低于EMR组的(7.82±1.01)ng/L、(67.13±6.94)μg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);随访3年,ESD组残留率9.76%与EMR组的22.73%比较差异无统计学意义(P>0.05),ESD组复发率为4.88%,明显低于EMR组的20.45%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ESD治疗GI-NENs可有效切除病灶,提高病灶切除效率,降低血清IL-6、CgA水平,减少患者复发风险,但手术并发症较多,手术花销较大。

Rv0222/ESAT-6融合蛋白对结核病的诊断价值

目的:探讨Rv0222/ESAT-6融合蛋白对结核病的血清学诊断价值。方法:表达、纯化重组Rv0222/ESAT-6融合蛋白,以其为抗原包板、以酶标抗体为二抗、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结核患者、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染合并结核患者、非结核患者以及正常人血清,评价该融合蛋白对结核病的诊断价值。结果:以结核分枝杆菌感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT,简称T-SPOT)为金标准,将Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原的ELISA诊断结核病的敏感性为86%,特异性为100%;T-SPOT与ELISA对结核病的阳性检出率差异无统计学意义。结论:以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原的ELISA对结核病(包括HIV合并结核病)的血清学诊断有一定价值。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白免疫优势肽段的重组表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌(MTB)ESAT-6免疫优势肽段(ESAT-6P)的基因表达工程菌,以获得大量重组肽段。方法根据编码ESAT-6P的MTB基因序列,设计1对特异引物,通过PCR技术从H37Rv基因组DNA扩增出ESAT-6P编码基因,目的片段克隆到原核表达载体pET-30 a中,构建N端带有6H is-tag的表达载体。将重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达产物,斑点免疫结合法(D IBA)鉴定重组肽段的免疫反应性。结果成功诱导表达ESAT-6蛋白的免疫优势肽段,与表达载体氨基酸序列融合后,表达产物相对分子质量约为16 500,该重组肽段以包涵体形式存在。D IBA结果表明,该重组肽段可被结核患者血清特异识别。结论获得MTB ESAT-6免疫优势肽段的基因表达工程菌,为将此重组肽段应用于结核诊断试剂和新型疫苗的研制奠定了基础。

支气管肺泡灌洗液中β-联蛋白、转化生长因子β_1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6在支气管肺发育不良中的表达及意义

目的探讨β-联蛋白、转化生长因子β1(TGF-β1)、Clara细胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)在支气管肺发育不良(BPD)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达及其意义。方法机械通气早产儿70例,其中40例诊断为BPD的患儿作为观察组,30例非BPD患儿作为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测两组患儿机械通气1、24、48、72hBALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平。结果观察组平均胎龄及出生体质量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。随机械通气时间的延长,观察组cc16水平呈逐渐降低趋势,而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势,且48、72h时均与1h时各指标水平差异有统计学意义(P<0.01)。对照组TGF-β1、cc16于机械通气72h时与1h时水平差异有统计学意义(P<0.01),而β-联蛋白、KL-6水平在各时间点的差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组机械通气各时间点β-联蛋白、TGF-β1水平均显著高于对照组各相应时间点指标水平,cc16显著低于对照组水平,差异有统计学意义(P<0.05),而KL-6在机械通气48、72h时高于对照组相应时间点,差异有统计学意义(P<0.05),余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。各时间点比较,BPD中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05),而cc16水平显著低于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。多元逐步回归分析结果显示,机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素(P<0.01)。结论机械通气早产儿BPD的发生与机械通气、吸氧时间的延长及低cc16水平密切相关,通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿BPD的发生提供预测依据。

金黄色葡萄球菌ESAT-6分泌系统研究进展

金黄色葡萄球菌是临床重要的致病菌,引起的感染可以累及全身各脏器,严重威胁人类健康。ESAT-6分泌系统广泛存在于革兰阳性菌。在金黄色葡萄球菌中,经典的ESAT-6通路由esxA、esxB及其他9个分子组成的基因簇构成,该系统分泌的ESAT-6/WXG100家族蛋白对金黄色葡萄球菌的毒力和免疫防御功能起到重要作用。该文就金黄色葡萄球菌ESAT-6分泌系统的研究进展进行综述。

牛分枝杆菌ESAT-6蛋白抗体间接ELISA方法的建立

利用分子克隆技术,提取结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因,然后对其进行克隆表达,获得高效表达的ESAT-6蛋白,Western blot证实ESAT-6蛋白可与结核牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的ESAT-6重组蛋白作为诊断抗原建立的间接ELISA特异性为94%、敏感性为63.35%。交叉反应试验表明,该抗原只与牛副结核病阳性血清有交叉反应,而不与其他5种常见的牛病阳性血清发生交叉反应。用间接ELISA方法对285份PPD阳性牛血清、对74份PPD阴性牛血清、79份牛γ-干扰素(IFN-γ)检测阳性血清进行检测,其负荷率分别为62.1%、98.64%、83.54%。实验结果表明建立的间接ELISA方法可以用于牛结核病感染和免疫抗体检测,且具有很好的开发和应用前景。

牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析

为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。

结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6研究新进展

结核分支杆菌的多种分泌蛋白已成为现今对该菌研究的热点,如Ag85复合物、MPT64、ESAT-6及Mtb8.4等,其中结核分支杆菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)是从结核杆菌短期培养滤波(ST-CF)中分离的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在卡介苗(BCG)各菌株中缺乏其编码基因,可望成为人和动物结核病的特异性诊断试剂、抗结核病亚单位疫苗的侯选抗原和结核病DNA疫苗的侯选目的基因。

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E.coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入E.coliBL21(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis.BindResins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。

唾液腺非乳腺样分泌癌中乳腺球蛋白的表达及ETV6基因重排

目的 :分析乳腺球蛋白(mammaglobin,MMG)在唾液腺非乳腺样分泌癌中是否存在表达,以及有表达者是否存在ETV6基因分离,以评价MMG及ETV6基因检测在唾液腺癌病理诊断中的价值。方法 :选取95例唾液腺非乳腺样分泌癌(包括20例腺泡细胞癌,10例多形性低度恶性腺癌,6例唾液腺导管癌,9例囊腺癌,6例低度恶性筛状囊腺癌,14例黏液表皮样癌,14例恶性多形性腺瘤,16例腺样囊性癌)行MMG免疫组织化学染色,利用荧光原位杂交(FISH)技术进一步分析阳性染色的病例。结果:29/95例病例出现MMG阳性表达,其中17例为MMG强阳性,包括4/6例唾液腺导管癌、4/6例低度恶性筛状囊腺癌、4/9例囊腺癌、3/8例恶性多形性腺瘤(腺癌)、1/10例多形性低度恶性腺癌、1/4例高度恶性黏液表皮样癌。全部29例MMG阳性肿瘤经FISH检测,均未发现ETV6基因分离。结论:MMG在部分非乳腺样分泌癌中阳性表达,尤其在唾液腺导管癌、低度恶性筛状囊腺癌、囊腺癌中有较高比例的强阳性表达,但MMG阳性表达的非乳腺样分泌癌均不存在ETV6基因分离,提示MMG在鉴别诊断中作用有限,必要时还需辅助分子检测。

利用大肠杆菌外膜蛋白A分泌表达人IL-6R突变体

白介素6(IL-6)是一种多功能的细胞因子,但其过高表达又往往与许多疾病的发生和发展有关,因而有必要构建白介素6受体(IL-6R)拮抗剂,用于拮抗IL-6的作用。可溶性IL-6R(sIL-6R)只能起IL-6激动剂作用,而与IL-6结合但不能与gp130相互作用的sIL-6R突变体则有可能拮抗IL-6的作用。为此,我们构建了sIL-6Rα亚基的突变体分子,并利用大肠杆菌外膜蛋白A(ompA)分泌信号肽分泌表达了双突变体C277D/H280I。

白念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶6诱导人单核细胞凋亡

目的检测白念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶6(Sap6)对人类单核细胞系(THP-1细胞)增殖的影响,明确Sap6蛋白是否具有诱导单核细胞凋亡的活性。方法用XTT比色法检测25、50μg/ml Sap6对THP-1细胞增殖率的影响;在流式细胞仪下用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测25、50μg/ml Sap6诱导THP-1细胞凋亡情况;用Con A-FITC/DAPI双染法在荧光显微镜下观察Sap6作用于THP-1细胞的位置。结果与25μg/ml比较,50μg/ml Sap6蛋白显著抑制人THP-1细胞增殖率(P=0.0001),并提高THP-1细胞早期凋亡率(P=0.0001);Sap6蛋白进入THP-1细胞内,结合于细胞核。结论白念珠菌分泌的Sap6在体外能够进入人单核细胞内,诱导凋亡,从而抑制细胞增殖率。