结核分枝杆菌mpt59和esxA融合基因编码蛋白的原核表达及免疫原性观察

目的:获取结核分枝杆菌mpt59和esx A基因编码的原核表达融合蛋白,并将该蛋白初步用于结核患者的快速诊断。方法:PCR扩增含有柔性链接肽段的esx A核苷酸序列,并将其连接至原核表达载体p ET28a上,再将mpt59连接至p ET28a-esx A上。该融合蛋白在大肠杆菌BL21中原核表达后,用镍珠子进行亲和纯化。采用垂直电泳和免疫印迹分析重组蛋白,并用于结核患者的诊断。结果:成功构建了原核表达载体p ET28a-esx A-mpt59,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。用该纯化蛋白进行ELISA检测,结果表明其诊断结核的灵敏度为97.8%,特异度为100%。结论:构建了含mpt59和esx A融合抗原基因的原核表达载体,并诱导表达了融合蛋白,为进一步研究结核分枝杆菌疫苗或诊断试剂奠定了基础。

罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达

Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。

儿童结核病结核分枝杆菌临床分离株中esxA、fbpB、Rv2660c基因多态性研究

目的对抗原编码基因esxA、fbpB、Rv2660c进行测序,了解esxA、fbpB、Rv2660c的基因多态性。方法选取135株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,运用PCR方法扩增目的基因esx A、fbp B、Rv2660c并进行测序,与结核标准株H37Rv基因序列以及从免疫表位数据库(immune epitope database,IEDB)中查询到的表位序列进行对比,分析esx A、fbp B、Rv2660c基因序列中的变异特征。结果在135株菌株中,esx A、Rv2660c序列暂未发现基因变异。fbpB共66株(48.89%)发现了基因变异,5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点共造成8个(14.81%)T细胞抗原表位以及9个(24.32%)B细胞抗原表位序列的多态性。fbpB基因的d N值为0.000 120,d S为0.002 126,其中T细胞表位区与非T细胞表位区的d N值分别为0.000 067和0.000 408,d S分别为0.002 382和0.000 470,B细胞表位区dN和dS值分别为0.000 063和0.002 380,非B细胞表位区dN和dS均为0。结论 esxA、Rv2660c基因序列较保守,fbp B存在基因多态性,预测会对蛋白Ag85B的免疫功能造成影响,从而影响H56的免疫有效性。

金黄色葡萄球菌亚单位疫苗EsxA-EsxB-Flic载体构建及蛋白表达纯化

为了预防金黄色葡萄球菌感染,减少畜牧业的经济损失,试验采用鞭毛蛋白Flic与金黄色葡萄球菌毒力因子EsxA、EsxB组成2 133 bp的融合基因Esx A-Esx B-Flic,在大肠杆菌内扩增表达质粒,裂解细菌后提取总蛋白,再通过His标签纯化出Esx A-Esx B-Flic融合蛋白。结果表明:该方法简单高效,能快速获得大量纯化的目的蛋白,可用于新型抗金黄色葡萄球菌融合蛋白亚单位疫苗研究。

结核分枝杆菌ESXB-ESXA融合蛋白的表达及其作为检测抗原的初步应用

目的:探索一种大量表达结核分枝杆菌ESXB-ESXA融合蛋白的方法,分析其抗原性,评价其在结核抗体检测中的初步应用。方法:采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中分别扩增esxB和esxA基因,用Linker(G4S)3连接2条目的片段,连接pET-32a(+)载体,构建ESXB-ESXA融合蛋白表达载体;重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,Western印迹分析重组蛋白的抗原性;建立以融合重组蛋白为抗原的ELISA和胶体金检测方法,分析其在结核病抗体检测中的应用。结果:构建了ESXB-ESXA融合蛋白的表达载体,重组ESXB-ESXA在大肠杆菌中得以高效表达,表达量占菌体总蛋白的70%以上;Western印迹分析表明该重组蛋白具有较好的抗原性;ELISA和胶体金检测结果显示,用重组ESXB-ESXA抗原检测临床结核病患者有较好的特异性。结论:重组ESXB-ESXA融合蛋白表达量高并具有较好的抗原性,可作为结核病抗体检测的备选抗原。

土地类芽胞杆菌(Paenibacillus terrae)NK3⁃4 EsxA结构与系统发育分析

前期研究在植物根际促生菌土地类芽胞杆菌(Paenibacillus terrae)NK3⁃4中发现一个EsxA编码基因,为明确该基因编码的蛋白的性质、结构及系统发生关系,对该基因进行了生物信息学分析。分析表明,该EsxA含有91个氨基酸,分子质量10276.53 Da,理论pI 5.29,分子式为C445H711N125O146S4,弱酸性,亲水,具有WEG保守基序,属于WXG超级家族成员;建模预测表明,自然状态下EsxA形成不对称的同源二聚体,其中每个亚基都由一个β折叠连接两个α螺旋组成,两个α螺旋反向平行排列;二聚体中两个亚基的肽链呈反向排列,所有N末端和C末端均暴露在外,形成棒状表面形态,其中一个亚基的N端的不规则卷曲形成与棒状二聚体垂直的短柱形凸起;系统发育分析显示,EsxA在种内及种间进化关系虽是不保守的,但类芽胞杆菌源的EsxA与病原细菌的EsxA同源性较低,暗示类芽胞杆菌源EsxA可能与病原微生物的EsxA具有截然不同的功能。结果为包括NK3⁃4菌株在内的类芽胞杆菌属EsxA外源分泌表达条件,活性保持及功能的深入研究提供了理论依据。

金黄色葡萄球菌EsxA基因的克隆及表达

目的在原核质粒中克隆金黄色葡萄球菌(S.aureus)Esx A基因,并进行表达及纯化,为其功能研究奠定基础。方法根据Gene Bank中S.aureus Esx A序列,设计特异性引物PCR扩增Esx A基因,PCR产物纯化后经Eco RΙ和XhoΙ双酶切,连接至p ET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,His柱纯化重组Esx A蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白的表达。结果成功克隆Esx A基因,基因全长294 bp,起始于ATG,终止于TAA,预测的分子量为11 036.2,等电点为4.61,经双酶切在294 bp处可见目的条带,基因测序显示Esx A在正确阅读框内,提示重组蛋白构建成功。SDS-PAGE显示重组蛋白在分子量大约14.5×103 Mr处左右见到可溶性的蛋白表达,Western blot分析识别14.5×103 Mr重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功克隆表达Esx A蛋白,为其功能研究奠定基础。

牛乳源金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的表达及免疫原性分析

为分析牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EsxA蛋白的免疫原性,构建EsxA-p ET-28a重组表达质粒,重组质粒经诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后重组EsxA蛋白免疫小鼠,用间接ELISA检测免疫小鼠血清中的IgG、IgG1和IgG2a水平;免疫小鼠经S.aureus菌株攻击后,检测小鼠肝、脾、肾组织荷菌数和免疫保护率,观察S.aureus菌株攻击后小鼠肝、脾、肾病理组织学变化。结果表明,成功诱导表达了EsxA重组蛋白,该重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价可达1∶900,与对照相比,重组蛋白免疫后可减少小鼠肝、脾、肾组织的荷菌数,减轻这些脏器的病理损伤,对免疫小鼠保护率达75%。上述结果表明,该重组Esx A蛋白具有良好的免疫原性。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的生物学信息预测

目的在线软件分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的生物学信息,为防治金黄色葡萄球菌感染提供理论基础。方法采用在线分析系统蛋白质EXPASYP Protemic(http://www. espasy. org)中的Protparam(http://expasy.org/tools/protparam.html),分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的分子质量、分子式,氨基酸数目、等电点、正负电荷残基,预测该蛋白的稳定性等理化性质;利用在线分析蛋白质软件Protscale(http://www.espasy.org/cgibin/protscale.p1)分析EsxA蛋白亲(疏)水性;采用SOPMA软件预测和分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的二、三级结构。结果 EsxA蛋白二级结构α螺旋(Hh)占26.15%(68个),延伸链(Ee)占32.69%(85个),无规则卷曲(Cc)占33.46%(87个)。蛋白分子质量为30 428.46 ku;理论pI值为8.18;氨基酸序列Ala占1.9%,Arg占1.9%,Val占3.5%。可能是亲水性蛋白;预测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的糖基化位点为71、87、146、176、200、243氨基酸处,预测存在1个丝氨酸、1个苏氨酸、3个酪氨酸磷酸化位点;同源建模中EsxA蛋白的GMQE值为0.75,Qmean向上手势,模型质量获得较高。结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌EsxA蛋白含有磷酸化位点和糖基化位点,具有免疫原性的基础结构。

金黄色葡萄球菌阳性儿童血清EsxA特异性抗体的检测

目的分析金黄色葡萄球菌培养阳性儿童血清EsxA特异性IgG、IgG1、IgG2水平,探讨金黄色葡萄球菌阳性儿童EsxA相关免疫特性,为其功能研究奠定基础。方法在使用抗生素治疗前收集经实验室鉴定为金黄色葡萄球菌阳性的儿童血清92例及健康体检者血清92例,用纯化的EsxA重组蛋白包被ELISA板,检测血清EsxA特异性IgG、IgG1及IgG2吸光度。结果金黄色葡萄球菌阳性组血清IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体吸光度值与对照组比较,差异均有统计学意义(P <0. 05)。92例金黄色葡萄球菌阳性儿童血清以痰液标本为主,占38. 0%;其次为皮肤脓液(占16. 3%)、咽拭子(占15. 2%)、扁桃体分泌物(占14. 1%)。结论金黄色葡萄球菌阳性儿童血清EsxA特异性IgG、IgG1、IgG2水平显著升高,提示EsxA可刺激机体产生体液免疫,机体免疫趋向Th1型。

AN融合抗原制备及其加强BCG免疫效果的研究

亚单位疫苗研究中抗原的选择对疫苗效果至关重要.本研究选取结核分枝杆菌中ESX-Ⅰ~ESX-Ⅴ分泌系统的同源蛋白EsxA,EsxC,EsxE,EsxT,EsxN构建融合蛋白AN,通过序列分析、实验动物模型评估其作为亚单位疫苗的可行性.AN抗原的一级结构中存在332个T细胞受体强结合位点,说明融合抗原AN能够提供更多的T细胞识别表位.纯化后的AN抗原免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾细胞进行胞内因子染色(ICS),结果证明AN抗原能激起高于或接近Ag85A的Th1型细胞因子分泌,具有较强的免疫原性,可以作为构建亚单位疫苗的候选抗原.利用BALB/c小鼠模型评估AN对于BCG免疫的加强保护效应,发现单次AN加强免疫,可使小鼠脾脏细菌清除率增加70.2%,增强了重组BCG的保护效果.

融合蛋白ABF对金葡菌感染版纳微型猪近交系皮肤创伤的修复作用

随着金葡菌对畜牧业破坏性增加和耐药性增强,人们对研发靶向金葡菌的有效保护性疫苗日趋迫切。为开发出更具免疫保护效力的抗菌疫苗,本研究首次利用Esx A、Esx B联合细菌鞭毛蛋白Flic,即制备出融合蛋白ABF,并在版纳微型猪近交系皮肤创伤模型上做实验验证。实验用版纳微型猪分为4组:对照组、模型组、实验组Ⅰ和实验组Ⅱ。结果发现单独使用Esx B蛋白与对照组微型猪的免疫指标之间差距并不显著,而预先经融合蛋白ABF免疫的微型猪,检测到其外周血免疫因子Ig G总量表达显著上升,即机体体液免疫水平提高,同时融合蛋白ABF可以激活T细胞。此外其脾脏淋巴细胞CD8a、CD3e和IFN-γ阳性率均显著增高,皮肤创伤修复速度加快。总之,本实验研究成果证实融合蛋白ABF可作为潜在有效的金葡菌亚单位疫苗,为防治金葡菌提供新的研究途径。