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利用绿色荧光蛋白标记产肠毒素大肠杆菌F4ac
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作者 靳荣理 薛鹏翔 +4 位作者 范庆花 马晓云 唐辉 张勤 王文文 《中国动物检疫》 CAS 2023年第3期111-117,共7页
利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4ac中,获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应(polymeras... 利用电击转化法将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的原核表达载体pTurboGFP-B转化到产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F4ac中,获得表达绿色荧光的菌株ETEC F4ac-GFP。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结果显示,转化菌株表达绿色荧光蛋白编码基因,且可以在蓝光仪和荧光显微镜下清晰地观察到转化菌株发出绿色荧光;将ETEC F4ac-GFP与IPEC-J2细胞系进行体外粘附试验,在细胞水平验证了转化菌株荧光表达的稳定性与可靠性,且ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的胞粘附能力。CCK-8(Cell Counting Kit-8)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,ETEC F4ac导入荧光质粒后不改变其对宿主细胞的毒力。本研究为深入探究ETEC F4ac致病机理提供了工具菌株。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠杆菌f4ac 绿色荧光蛋白 粘附 稳定性
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F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用 被引量:2
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作者 周传丽 刘铮铸 +1 位作者 俞英 张勤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期779-785,共7页
【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致... 【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC培养液的免疫原性尚未有研究和描述。论文以F4ac型ETEC为研究对象,探索其菌液上清(即培养液)对仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培养12h后的培养液,后经4℃,4 000 r/min,离心15 min收集培养液上清,将该上清液经0.22μm滤器过滤,并与DMEM/F12培养基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2细胞3 h,重复此处理3次获得处理组细胞;同时设新鲜的LB培养基与DMEM/F12培养基同样以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2细胞为对照组细胞,对照处理亦重复3次。然后用TRIZOL试剂按照说明书提取对照组和攻毒组IPEC-J2细胞的总RNA,并用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(反转录试剂盒)按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实时荧光定量PCR方法,以猪的持家基因β-actin作为内参,检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA表达差异性。【结果】较之对照组,在攻毒组中,3个重要的促炎细胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出现了显著性地过表达。其中,在攻毒组中,IL8的表达量为对照组的3.24倍(P<0.05);TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍(P<0.01);CXCL2的表达量为对照组的1.65倍(P<0.001)。在攻毒组和对照组之间,其他6个基因(IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13)的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培养液上清对IPEC-J2细胞系进行3 h攻毒处理,并通过荧光定量PCR方法检测到了3个重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac型ETEC培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺激作用。研究为更明确地了解猪F4ac型ETEC释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用提供了一定的实验证据。 展开更多
关键词 f4acetec 菌液上清 IPEC—J2细胞 荧光定量PCR 免疫刺激作用
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仔猪抗大肠杆菌性F4ac腹泻病分子遗传机理研究进展
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作者 张婷 廖金龙 +2 位作者 柴晶党 叶丹 欧阳婧 《安徽农业科学》 CAS 2016年第13期144-145,200,共3页
产肠毒素大肠杆菌F4ac(ETEC F4ac)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌,分离和鉴别猪ETEC F4ac受体目的基因及因果突变位点成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。对仔猪抗大肠杆菌性腹泻病分子遗传机理研究进展进行综述,以期为... 产肠毒素大肠杆菌F4ac(ETEC F4ac)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌,分离和鉴别猪ETEC F4ac受体目的基因及因果突变位点成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。对仔猪抗大肠杆菌性腹泻病分子遗传机理研究进展进行综述,以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。 展开更多
关键词 仔猪 etec f4ac 遗传机理
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猪氨肽酶N基因的克隆、表达系统构建和鉴定 被引量:5
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作者 夏芃芃 宋玉洁 +1 位作者 段进坤 朱国强 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期1-4,14,共5页
为探讨猪氨肽酶N(APN)作为产肠毒素性大肠杆菌F4ac的受体蛋白的可能性,根据GenBank上的猪APN mRNA序列设计合成特异性引物,从新鲜的猪小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪APN全长基因,并分别构建真核表达和原核表达... 为探讨猪氨肽酶N(APN)作为产肠毒素性大肠杆菌F4ac的受体蛋白的可能性,根据GenBank上的猪APN mRNA序列设计合成特异性引物,从新鲜的猪小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪APN全长基因,并分别构建真核表达和原核表达系统。结果表明:APN基因已正确插入pcDNA3.1真核表达载体和pET-28a(+)原核表达载体,SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在110ku处有单一明显条带。pcDNA3.1-APN和pET28a-TAPN双系统的成功构建以及APN蛋白的成功表达,为进一步研究和验证该蛋白作为猪F4ac受体候选蛋白的可能性奠定基础。 展开更多
关键词 猪氨肽酶N 产肠毒素性大肠杆菌f4ac 真核表达 原核表达
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产肠毒素大肠埃希菌sfmH基因的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 丁雪燕 岑雪 +3 位作者 田延 吴文文 夏芃芃 朱国强 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS 北大核心 2018年第4期12-16,共5页
以产肠毒素大肠埃希菌F4ac(F4ac^+ETEC)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Sfm菌毛操纵子顶端黏附素sfmH基因,然后将PCR产物插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建出阳性重组质粒pET-28a(+)-sfmH,再将其导入大肠埃希菌BL21中进行诱导表达。通过... 以产肠毒素大肠埃希菌F4ac(F4ac^+ETEC)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Sfm菌毛操纵子顶端黏附素sfmH基因,然后将PCR产物插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建出阳性重组质粒pET-28a(+)-sfmH,再将其导入大肠埃希菌BL21中进行诱导表达。通过对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行探究,发现重组菌在0.8mmol·L^(-1)IPTG、25℃诱导7h时蛋白表达量最高,且重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为26ku。将重组蛋白在最优诱导条件下进行大量表达并纯化,利用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得SfmH多克隆抗体(简称多抗),通过ELISA和Western blot试验对多抗效价和特异性进行鉴定。这一研究构建并获得了高纯度的融合蛋白rSfmH,将其免疫小鼠后成功获得鼠源高免血清,为进一步探究Sfm菌毛的功能奠定了研究基础。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠埃希菌f4ac Sfm菌毛 sfmH基因 原核表达
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Polymorphisms of three gene-derived STS on pig chromosome 13q41 are associated with susceptibility to enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac in pigs 被引量:8
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作者 HUANG Xiang 1 ,REN Jun 1 ,YAN XueMing 1,2 ,PENG QiuLing 1 ,TANG Huan 1 ,ZHANG Bo 1 ,JI HuaYuan 1 , YANG ShuJin1&HUANG LuSheng 1 1Key Laboratory for Animal Biotechnology of Jiangxi Province and the Ministry of Agriculture of China,Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045,China 2Department of Biology,Nanchang University of Science and Technology,Nanchang 330038,China 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 2008年第7期614-619,共6页
Neonatal diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)F4 is a common and serious disease,resulting in significant economical loss in the pig industry.The locus encoding ETEC F4 receptor has been mapped to ... Neonatal diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)F4 is a common and serious disease,resulting in significant economical loss in the pig industry.The locus encoding ETEC F4 receptor has been mapped to pig chromosome(SSC)13q41,and one of the most significantly linked markers is S0075.In this study,we selected three genes including SLC12A8,MYLK and KPNA1 from a chromosomal region flanking S0075 on SSC13 to develop pig specific sequence tagged sites(STS). Seven single nucleotide polymorphisms were identified in the three pig STS using DNA of four full-sib susceptible and resistant animals in a White Duroc×Erhualian intercross.All grandparents,parents and 755 offspring in the intercross were genotyped for three polymorphisms,including SLC12A8 g.159A>G,MYLK g.1673A>G and KPNA1 g.306A>G.Family-based transmission disequilibrium test(TDT) revealed that all polymorphisms and the corresponding haplotypes are significantly associated with ETEC F4ab/ac(especially F4ac)brush border adhesion phenotypes,indicating that these polymor- phism are in linkage disequlibrium with causal mutation(s)of the gene encoding ETEC F4ab/ac receptor. Our results strengthen the evidence for the involvement of SSC13q41 in high acquiring risk of ETEC F4ab/ac infection,and provide novel polymorphic markers for fine mapping of the ETEC F4ab/ac receptor locus. 展开更多
关键词 PIG SSC13q41 sequence tagged sites(STS) ESCHERICHIA coli(etec)F4ab/ac SUSCEPTIBILITY
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