以EV71抗原检测方法验证浅析生物制品生物效价检测方法学验证

目的:本文以对生物制品生物效价检测进行规范的《中国药典》2020年版新增9401指导原则为标准进行EV71抗原检测方法的验证,进一步浅析生物制品生物活性/效价检测的方法学验证。方法:依据《中国药典》2020年版9401指导原则,结合EV71抗原检测方法特点及验证目的对其进行专属性、相对准确度、精密度、线性和范围5个方面进行方法学验证。结果:EV71抗原检测方法专属性强,6个效价水平几何变异系数为4.7%~13.0%,均小于15%,相对偏倚为-6.05%~9.03%,均在±15%范围内,定量范围为225%~31%,线性回归相关系数为0.999 5,5方面验证均符合要求,且适用于该检测方法的使用。结论:本原则可具体指导生物学检测方法验证,在对不同检测方法进行验证时,根据检测目的、方法的原理、方法的技术特点、被检物的成分等设计具体方案。

肠道病毒71型手足口病患者外周血淋巴细胞增殖反应

目的研究肠道病毒71型(EV71)手足口病患者外周血淋巴细胞对不同EV71抗原刺激的增殖反应。方法将38例研究对象分为手足口病EV71阳性重症组8例、轻症组10例、EV71阴性组10例、健康对照组10例。外周血单核细胞(PBMC)与EV71合成多肽SP1、SP2、SP3、灭活EV71和植物血凝素(PHA)分别共同孵育,加入胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),然后收集细胞于液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。结果对不同EV71抗原的淋巴细胞增殖反应发现,以灭活病毒EV71免疫原性最强,SP2次之。EV71轻症和重症患者淋巴细胞增殖反应比较差异无统计学意义(P>0.05),EV71阴性手足口病患者及健康对照组对EV71抗原未能显示有效的淋巴细胞增殖反应。结论灭活EV71免疫原性最强,感染EV71的患者淋巴细胞对EV71抗原刺激呈特异性增殖反应。

人肠道病毒71型VP1和VP4的抗原融合表达及鉴定

目的:构建人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)VP1-VP4重组融合蛋白表达体系.方法:构建EV71 VP1-VP4重组融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白VP1-VP4,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定.用融和蛋白包被ELISA板检测41例已知血清.结果:重组片段VP1-VP4测序结果与设计目的片段序列相符,重组载体构建成功;SDS-PAGE显示融合蛋白约42.8kDa,与预期值一致;Westernblot提示该融合蛋白可以和EV71 VP1、VP4抗体特异性结合.融合蛋白包被ELISA板能准确检测出41例血清中16例EV71阳性血清,与CA16无交叉反应.结论:表达的EV71 VP1-VP4融合蛋白具有良好的抗原性,可作为EV71感染检测抗原,为EV71诊断试剂和疫苗的研究奠定实验基础.

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16鼠源性广谱中和活性单克隆抗体的制备

目的制备可以同时阻断肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)感染的中和活性单克隆抗体(mAb)。方法采用EV71病毒体蛋白1(VP1)羧基端的163~177位氨基酸(SP55)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备mAb,用EV71中和抗原表位SP55以及高度同源的CV-A16 VP1羧基端的第163~177位氨基酸(PEP55)同时进行检测,筛选同时与EV71和CV-A16发生交叉反应的mAb,并进行体外中和试验检测对EV71和CV-A16的中和作用,并分析mAb的生物学特性。结果筛选获得1株可以同时中和EV71及CV-A16的mAb 6E5,其重链为IgG1亚类,轻链为Kappa链;细胞微量中和实验表明其抗EV71感染的中和效价为1∶128,抗CV-A16感染的中和效价为1∶32。结论成功获得1株能同时中和EV71及CV-A16的广谱中和活性mAb。

人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型B细胞线性表位的生物信息学预测

发展了人肠道病毒B细胞线性表位(简称线性表位)的生物信息学预测算法,系统性地预测和比较了人肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16,CVA16)的线性表位.结果显示:EV71和CVA16结构蛋白(Viral Protein, VP)上都有16个线性表位,2种肠道病毒的线性表位的位置高度一致,但氨基酸序列保守性较低,大多数表位都存在至少3个氨基酸残基的差异,提示2种病毒的线性表位具有血清型特异性,这很可能是两者不能交叉反应的原因.线性表位主要分布在β链之间的环上和C-末端,分别有13个(81.3%)和2个(12.5%)表位.与文献报道相比较,16个线性表位中,分别有6个(37.5%) EV71和12个(75%) CVA16的表位已被实验验证.特别是实验研究重点关注的VP1,6个预测表位中,分别有4个(66.7%) EV71的预测表位和5个(83.3%)CVA16的预测表位已被实验所验证.说明算法具有较高的预测可靠度.线性表位的实验研究主要集中在VP1,预测结果提示VP2和VP3也能形成表位,应该加以重视.生物信息学算法通过预测和筛选潜在的线性表位,能够大大降低实验负荷,为包括EV71和CVA16在内的人肠道病毒的研究提供有力支持.对肠道病毒线性表位的预测,有助于更好地监测和预警手足口病疫情,辅助疫苗的研发和准备.

EV71抗原BA-ELISA检测方法的建立及应用

目的建立EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)检测方法,并进行验证及初步应用。方法以抗EV71抗体为包被抗体,利用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA法,并对其灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。采用该方法检测组织培养及临床样品中EV71抗原的含量。结果所建立的BA-ELISA法在EV71蛋白含量625～156.25ng/ml之间线性关系最佳,R2达0.9976,灵敏度为78.125～156.25ng;与包括CoxA16在内的42种肠道病毒及相关病毒均无交叉反应;检测10份EV71阳性样品和10份阴性样品,结果符合率均为100%;检测EV71原液和高、中浓度样品的变异系数分别为3.09%、6.69%和6.43%;可检出约103～104CCID50的活病毒及手足口病患者的大便悬液和部分咽拭子悬液中的病毒。结论用生物素标记EV71抗体与亲和素系统建立的双抗体夹心ELISA法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性,为临床检验及抗原分析提供了参考。

EV71抗原ELISA定量检测方法的建立

目的建立EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于EV71灭活疫苗生产过程中抗原含量的检测。方法采用EV71全病毒免疫,制备抗EV71单克隆抗体及多克隆抗体,以抗EV71多克隆抗体作为包被抗体,经HRP标记的抗EV71单克隆抗体作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测样品中EV71抗原含量,并对该方法进行验证及应用。结果所建立的方法线性范围为5～80U/ml,R2=0.994,线性关系良好,定量限度为5U/ml;检测不同浓度的EV71抗原内部参考品,回收率为88%～119.0%;变异系数均小于15%;与甲肝病毒收获液、乙脑病毒灭活液、H5N1流感病毒裂解疫苗原液、小牛血清、人白蛋白、Vero细胞、MEM培养基及CoxA16收获液均无交叉反应;检测EV71灭活疫苗原液纯化过程样品的抗原含量,能有效反映抗原纯化趋势;检测铝吸附疫苗成品解离后抗原含量,准确性较高。结论已建立了EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法线性好,特异性强,灵敏度高,准确性及重复性良好,可用于EV71疫苗生产过程中及终产品的抗原定量检测。

第二代肠道病毒71型(EV71)抗原国家标准品的建立

目的建立第二代肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原国家标准品,用于体外效力(EV71抗原含量)质量控制。方法选取与第一代EV71抗原国家标准品相同来源的原料和冻干方法制备候选标准品(CS),经均匀性和稳定性考核合格后,分发给4个实验室,以EV71抗原国际标准品(WHO IS)和第一代EV71抗原国家标准品(NS)为标准进行协作标定及适用性研究。结果 CS与WHO IS及CS与NS均具有良好的平行性和线性。以WHO IS为标准时,CS检测的平均值为2 316 IU/mL,实验室内CV为4.3%~9.3%,实验室间CV为7.1%,95%置信区间为2 229~2 403 IU/mL;以NS为标准时,CS检测平均值为2 437 U/mL,实验室内CV为3.9%~10.7%,实验室间CV为5.3%,95%置信区间为2 355~2 519 U/mL。以CS为标准检测各企业生产的EV71收获液、原液和疫苗均具有较好的平行性和线性,且准确率均位于90%~110%之间。在2~8和37℃放置56 d,CS抗原含量稳定;CS复溶后置2~8℃保存7 d或-20℃反复冻融5次,抗原含量残留率均未超过90%~110%。结论建立了第二代EV71抗原国家标准品,赋值2 320 IU/mL(相当于2 440 U/mL)。

EV71抗原表位的研究方法及研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员,是引起亚太地区手足口病暴发的主要病原体之一。EV71可引起严重的神经系统病变,对6岁以下儿童造成较高的死亡率。目前尚无上市的疫苗来预防EV71的感染。因此,研制EV71疫苗及治疗药物十分迫切。病毒中和表位是刺激机体产生特异性免疫反应的物质基础,研究其结构、功能对于疫苗的研发,特别是亚单位疫苗的研制、药物靶点筛选至关重要。本文主要对研究EV71抗原表位的方法及最新近况作一综述。

EV71抗原检测方法的建立及初步临床应用

目的建立EV71抗原双抗体夹心检测方法,并初步探讨其在临床血清样品检测中的应用。方法用抗EV71病毒单克隆抗体包被酶联反应板,加入待检标本反应后,用HRP标记的抗EV71病毒单克隆抗体进行检测,建立EV71抗原双抗体夹心检测方法;采用抗人IgM单克隆抗体包被96孔酶联板,辣根酶标记的EV71抗原,建立ELISA捕获方法检测抗EV71-IgM。2种方法同时检测230份体检人员血清,确定方法的cut-off(CO)值,并检测140份手足口病患者血清,采用Graraph Pad Prism 4软件作图并绘制ROC曲线。结果EV71抗原检测方法的CO值为0.168,抗EV71-IgM ELISA检测方法的CO值为0.173。在140例手足口病患者血清中,EV71抗原检测方法的阳性检出率为45.00%,抗EV71-IgM ELISA检测方法的阳性检出率为42.86%,其中共同阳性患者45例,单独EV71抗原阳性患者18例,单独抗EV71-IgM抗体阳性患者15例,如果2种方法联合检测,其阳性检出率可提高到55.71%。结论ELISA检测EV71抗原诊断HFMD具有很好的准确性,结合EV71-IgM抗体捕获检测技术,可进一步提高灵敏度,具有很好的临床应用前景。

肠道病毒71型灭活疫苗体外和体内相对效力试验的相关性

目的评价肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)灭活疫苗体外和体内相对效力试验检测结果的相关性。方法以EV71灭活疫苗上市以后1个自然年内生产的62批EV71灭活疫苗为研究对象,进行体外(抗原含量测定)和体内相对效力试验(ED50效力试验和中和抗体效价检测),并分析62批EV71灭活疫苗的抗原含量与半效稀释倍数、ED50效力、中和抗体效价的相关性及ED50效力与中和抗体效价的相关性。结果抗原含量与半效稀释倍数及中和抗体效价呈良好正相关(P<0.01),ED50效力与中和抗体效价呈显著负相关(P<0.01),抗原含量与ED50效力无相关性(P>0.05)。结论体外相对效力试验替代体内相对效力试验用于EV71灭活疫苗效力检测具有可行性。

肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗抗原检测方法的建立及验证

目的建立定量检测肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗抗原含量的检测方法,并进行验证。方法用EV71 VLP抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,并进行Protein A亲和层析纯化。以纯化的抗EV71 VLP多克隆抗体为包被抗体,筛选最佳包被浓度及酶标抗体稀释倍数,建立定量检测EV71 VLP抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并对该方法进行准确度、精密度验证,确定方法的线性范围和定量限。结果抗EV71多克隆抗体包被浓度5μg/mL,酶标抗体稀释度1∶10000条件下,建立了检测EV71 VLP抗原含量的双抗体夹心ELISA法。抗原标准品浓度在0.5~8 U/mL范围内,其对数值与对应的A450值对数值呈良好的线性关系,R^(2)=0.9927,定量限为2 ng/mL;准确度验证回收率为81%~106%;精密度验证相对标准偏差(RSD)为4.96%~12.04%。结论建立了用于EV71 VLP抗原定量检测的双抗体夹心ELISA法,有望用于EV71 VLP疫苗抗原含量的初步检测。

肠道病毒71型抗原检测板不同保存方法稳定性的比较

目的比较干燥保存及湿保存肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原检测板的稳定性。方法用羊抗EV71多克隆抗体包被96孔酶标板,制备20块EV71抗原检测板,10块板置空气干燥后真空包装,-25℃保存;另外10块板用洗涤液浸泡,封口后置4℃保存。分别于保存0、20、40、60、90、120、180 d时,检测5份EV71样品。结果干燥保存EV71抗原检测板检测5份样品7个时间点的均值分别为315.0、299.4、7795.3、827.6、261.4 U/mL,湿保存的EV71抗原检测板检测结果均值分别为354.3、347.1、6766.6、749.7、277.3 U/mL,各时间点两种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法保存180 d时,EV71抗原检测板均可保持较好的活性(P>0.05)。结论两种方法保存EV71抗原检测板6个月内,均具有良好的稳定性。

人肠道病毒71型抗原表位的研究进展

人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是重症手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体。我国已研发多种针对EV71的灭活疫苗,在大规模临床试验中取得了理想效果,其中,两种疫苗已于2016年上市,有望在保护儿童健康方面发挥重要作用。由于EV71通过快速进化来逃避宿主的免疫保护作用,因此需要对EV71的变异,尤其是抗原表位部分的变异,进行持续性监测,并及时更新疫苗。该文系统地收集和整理了EV71的抗原表位,简介了表位鉴定的实验和生物信息学研究方法,概述了表位参与的宿主免疫反应及抗病毒机制并展望了其临床应用价值。