阜阳市手足口病患儿EV71型肠道病毒中和抗体研究

目的研究手足口病(HFMD)患儿的血清EV71型中和抗体指标。方法对安徽阜阳2008年4～8月因手足口病(HFMD)住院的患儿采集血样,使用中和试验方法检测EV71型中和抗体滴度。结果共收集到83人113份血清样本,对这些样本的中和试验研究发现:①EV71抗体阳性率在发病1～3 d时为96%,已接近抗体阳性率高峰值;②随着病程的进展中和抗体呈现从较低到高的动态分布,其几何平均滴度(GMT)为388.3;③重症病例的中和抗体GMT为367.2,低于普通病例的中和抗体GMT值(421.3),但差异无统计学意义。结论以中和抗体为主的体液免疫指标将为EV71型手足口病防治提供参考和依据。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础。方法根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究。结果与结论建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障。

荆门地区肠道病毒EV71型感染的流行病学调查

目的探讨肠道病毒EV71型在湖北荆门地区手足口病流行病学中的重要意义。方法收集2008年荆门地区手足口病临床诊断病例682份,对该病发生地区、时间、人群分布进行统计;分离102份血清、粪便、咽拭子及疱疹液标本的病毒并运用RT-PCR扩增技术对其病原学进行检测。结果该市2008年手足口病城区发病率为113.55/l0万,农村发病率为49.26/10万,城区发病显著高于农村（P〈0.01）;流行季节以春季及初夏为主;病原学检查主要为EV71;2-3岁年龄段多发。结论手足口病流行具有明显的地域、时间、年龄等特点;EV71病毒是手足口病实验室诊断病例的主要病原。

福州地区肠道病毒EV71基因型特征的研究

目的研究福州地区肠道病毒71型(EV71)基因型特征,观察其年度变化及地区分布特点,以了解病毒变迁及传播方式。方法对住院患者肛拭子EV71阳性的样本,RT-PCT扩增VP1基因的部分片段,再进行核酸测序,以获得的基因片段构建系统发生树,观察不同地区及不同年度之间病毒基因同源性,了解病毒变迁情况。结果总共获得EV71病毒VP1基因片段64例,其中2013年10例,2014年14例,2015年40例,构建系统发生树,与网上发布的shzh98、shzh03和zhejiang08病毒株相比,均属于C4亚型。福州地区的病毒株,不同年度之间病毒变异不大;同一地区的病毒同源性很高,提示病毒在小范围内保存并持续传播。结论 2013-2015年福州地区手足口病主要病原EV71病毒属于C4亚型;系统发生树显示EV71同源性有较明显的地区分布特点,3年内病毒未出现明显变异。

四季抗病毒合剂及其主成分抗肠道病毒71型的作用及机制研究

目的探讨四季抗病毒合剂(Siji Kangbingdu Mixture,SJM)及其主成分(principal component,PC:连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷、甘草苷、甘草酸、木犀草苷、绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸)抗肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)增殖和感染的作用及其作用机制。方法MTS法检测SJM、PC对非洲绿猴肾细胞(Vero)的毒性;基于EV71感染细胞模型检测SJM、PC抗损伤的效果;基于EV71感染乳鼠模型观察SJM、PC对其存活率、存活时间、临床症状评分的改善情况;检测乳鼠模型肌肉与血清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平。结果(1)EV71对Vero细胞的半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-5.68·mL^(-1);(2)SJM、PC对Vero细胞的半数抑制质量浓度分别为11.83 mg·mL^(-1)(按生药量计)、20.67μg·mL-1(按连翘酯苷A计);(3)单次和连续给予SJM与PC对ICR乳鼠无明显致毒作用;(4)SJM与PC可显著抑制EV71的增殖,以提高被感染细胞的存活率;(5)SJM与PC可显著改善被感染乳鼠的存活率、临床症状等指标;(6)SJM与PC均可显著调节肌肉与血清中IL-6、TNF-α、MCP-1的水平。结论SJM与PC可显著抑制EV71的增殖,调节免疫炎症因子,PC可在一定程度上替代SJM,发挥治疗手足口病的重要作用。

重症EV71型病毒性脑炎患儿的护理

总结10例重症EV71型肠道病毒感染致病毒性脑炎患儿的护理。认为护理上要严密观察EV71型肠道病毒感染患儿神经系统改变情况,如出现呕吐、精神萎靡、肌无力,甚至惊厥表现,警惕病毒性脑炎。对于不典型的手足口病患儿,尤其是不典型皮疹,甚至没有皮疹的手足口病患儿,高度警惕EV71型病毒感染。做好并发症的观察与护理。本组8例救治成功,1例因昏迷转入重症监护室治疗后好转,1例因并发肺部感染全身皮疹消退后转入呼吸科治愈。

肠道病毒71型(EV71)通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞

目的研究肠道病毒71型(EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的内吞机制。方法利用氯丙嗪(CPZ)、制霉菌素(NT)分别预处理SK-N-SH细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测靶细胞中EV71 mRNA水平,免疫荧光细胞化学染色检测靶细胞病毒蛋白1(VP1)蛋白表达水平;EV71感染SK-N-SH细胞后,激光共聚焦显微镜检测EV71与入侵途径标志分子网格蛋白的共定位。结果 CPZ能抑制靶细胞内EV71 mRNA和VP1蛋白的表达,而NT对其无影响;激光共聚焦显微镜发现EV71与网格蛋白共定位。结论 EV71是通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞。

门诊肠道病毒EV71型感染患儿的临床观察与护理

目的促进肠道病毒EV71型感染患儿的康复,及早预防控制,加强消毒隔离,减少并发症,预防大流行。方法治疗期间采取呼吸道和消化道隔离、抗病毒及对症治疗,密切观察病情,预防并发症发生。结果本组68例患儿,57例经门诊治疗1周治愈,住院患儿中10例1周治愈,1例10 d治愈,未出现脑炎、脑膜炎、肺水肿、脑脊髓炎、循环衰竭等并发症及大流行,无院内感染。结论对肠道病毒EV71型感染患儿加强预防控制和消毒隔离措施,密切观察病情,及早发现,及时诊治处理,能减少并发症,防止大流行。

肠道病毒EV71型手足口病普通型疗效观察

目的:分析肠道病毒EV71型手足口病普通型患儿的临床治疗效果。方法:选取笔者所在医院2017年3-9月收治的肠道病毒EV71型手足口病普通型患儿98例,采用随机划分方法分为观察组与对照组,各49例,对照组患儿给予双黄连口服液及阿昔洛韦软膏治疗,观察组在其基础上给予维生素C颗粒联合治疗,观察比较两组患儿治疗效果。结果:观察组患儿治疗总有效率为95.92%(47/49),高于对照组的81.63%(40/49),差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患儿退热时间、口腔溃疡愈合时间等均少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:肠道病毒EV71型手足口病普通型患儿临床治疗中,维生素C颗粒、儿童双黄连口服液、阿昔洛韦软膏联合应用下,对提高患儿治疗效果、缩短患儿退热与口腔溃疡愈合时间可发挥重要作用,可在临床实践中推广应用。

2009年西安地区手足口病病原血清型分析及肠道病毒71型基因特征

目的了解西安地区2009年手足口病的肠道病毒血清型;评价IgM抗体检测在肠道病毒71(EV71)感染早期诊断中的意义;分析西安地区EV71 VP1基因特征。方法分别在西安市城区医院和郊县医院采集的标本共185份,RT-PCR法检测标本中的病毒核酸;采集EV71核酸阳性的急性期病例血液标本,ELISA法检测血清中IgM抗体;细胞培养分离EV71,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析。结果在185份标本中,156份检出肠道病毒核酸(84.32%),其中72.4%为EV71,17.3%为柯萨奇A16(CA16);63份EV71核酸阳性的急性期病例血清标本中,45份EV71 IgM抗体阳性(71.43%);分离到的12株EV71均为C4亚型。结论 2009年西安地区手足口病病原以EV71为主,且主要是C4亚型;ELISA方法可用于EV71感染的早期诊断。

银川市某医院体检人群EV71型和ECHO病毒感染率的调查

目的了解银川市不同年龄组人群肠道病毒71型(EV71型)和埃克病毒(ECHO)感染率情况及IgG抗体阳性率分布情况。方法采集宁夏银川市某医院204份不同年龄组体检人群血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的EV71型和ECHO IgG抗体。结果 204例受检人群血清中EV71型和ECHO IgG阳性率分别为32.4%和15.1%,其中1岁以内婴幼儿EV71抗体阳性率低,1岁～组EV71 IgG抗体阳性率最高达48.3%,但与其他组比较差异无统计学意义。1岁以内婴幼儿ECHO抗体阳性率低,随着年龄增长,抗体阳性率增高,15～65岁组ECHO IgG抗体阳性率最高,为22.3%,与其他组比较差异无统计学意义。结论普通人群中可能存在EV71型和ECHO隐性感染者,成人EV71隐性感染率较低,儿童是EV71的主要感染者,15岁以下儿童为ECHO感染的高危人群,人群通过自然感染获得免疫保护。

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

采用经典微量细胞病变法,应用近两年分离自中国手足口病（HFMD）高发区的3株肠道病毒71型（EV71）病毒株,对中国不同血液制品厂家生产的35批人免疫球蛋白制品进行抗-EV71中和效价检测。结果显示,3株不同EV71病毒株间的抗-EV71中和效价差异均在4倍以内,差异无显著的统计学意义（F=2.323,P〉0.05）。根据这3株毒株检测结果判定,35批人免疫球蛋白的抗-EV71均为阳性,肌肉注射用免疫球蛋白（简称肌丙）的抗-EV71-GMTs（525.9）显著高于静脉注射用免疫球蛋白（简称静丙）的GMTs（252.3,F=66.518,P〈0.01）。30批静丙的抗-EV71-GMTs中和效价分布在128.0-384.0之间。应开展原料血浆中抗-EV71中和效价的筛选,研制高效价的EV71特异性免疫球蛋白制品,用于HFMD的治疗和预防。

健康青年肠道病毒71型感染血清流行病学调查

目的了解入伍新兵人群肠道病毒71型（EV71）IgG抗体的流行分布情况，为今后预防EV71感染提供科学依据。方法采用血清流行病学调查方法，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，随机抽取北京军区空军2001至2008年8年期间入伍的来自16个省市的364名新兵血清进行了EV71VPl一IgG抗体检测并进行统计分析。结果364名新兵中，陕西省（100oA）、湖南省（100％）、福建省（95．46％）和云南省（95．46％）阳性率较高，其余各省阳性检出率相对较低；阳性率63．64％～100．00％，平均阳性率为87．64％，各省间和沿海与内陆地区间阳性检出比较，显著性检验差异有统计学意义。入伍前工作与否，抗体阳性检出率无显著性差异。结论目前，健康青年对EV71获得稳固免疫力，不易发生暴发流行。

肠道病毒71型疫苗免疫原性研究进展

肠道病毒71型是引起严重手足口病的主要病原体之一,近年在亚太地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点,已成为该地区的重大公共卫生问题。研发安全有效的疫苗是控制手足口病流行的有效手段,而疫苗的免疫原性评价是疫苗研发的关键。对EV71疫苗免疫原性的研究进行了综述。

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。

肠道病毒71型假病毒荧光定量检测方法在疫苗中和抗体检测中的应用

目的假病毒荧光定量方法 (PVLA)应用于EV71疫苗动物样本和人体样本检测的适用性研究。方法分别采用细胞病变法(CPE)和PVLA方法检测82份EV71试验小鼠血清以及27份疫苗临床试验人体血清样本,比较两者检测的一致性。结果应用两种方法检测82份疫苗免疫小鼠血清,EV71中和抗体滴度的相关系数为0.842,Bland-Altman分析显示高度一致性;检测27份EV71临床试验人体血清样本的中和抗体,两种方法具有高度一致性。结论 PVLA与CPE方法具有高度一致性,适用于疫苗免疫动物样本和临床评价人体样本EV71中和抗体的检测。

瑞香素体外抗肠道病毒71型的初探

目的探讨瑞香素对肠道病毒71型(EV71)感染人恶性胚胎横纹肌肉瘤(RD)细胞的影响。方法实验设定为4组:正常细胞组指不加药物及EV71干预RD细胞;病毒对照组指感染EV71的RD细胞;瑞香素组指不同浓度(根据瑞香素最大无毒浓度设定瑞香素作用浓度为15、12. 5、10、7. 5、5、3. 75、2. 5、1. 875、1. 25、1μg/m L)的瑞香素作用于感染EV71的RD细胞;阳性药物组是指50μg/m L利巴韦林(ribavirin,RVB)作用于感染EV71的RD细胞。运用CCK8测定法、细胞病变效应(CPE)、RT-PCR方法测定瑞香素在病毒感染不同阶段的抗EV71病毒作用。结果瑞香素对RD细胞的50%细胞毒性浓度(TC50)为33. 47μg/m L,最大无毒浓度(TC0)为15μg/m L。浓度为3. 75～15μg/m L瑞香素在EV71感染期和感染后期对EV71均有较好的抑制效果,其中12. 5、15μg/m L瑞香素的治疗效果相对较佳,其病毒抑制率与正常细胞组比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。浓度为15、10μg/m L的瑞香素在EV71感染细胞后再用药处理,能有效降低病毒载量;而以浓度为15、10、7. 5μg/m L瑞香素与EV71病毒混合作用于细胞,同样具有降低病毒载量的作用,均对EV71的复制有较好的抑制效果,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论瑞香素能有效抑制EV71的复制,有望为开发新的抗EV71药物提供实验依据。

HPLC-UV法检测EV71-CA16二价手足口病灭活疫苗原液相关抗原纯度的方法建立与评价

为建立一种准确可靠的高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)方法,检测EV71-CA16二价手足口病(HFMD)灭活疫苗原液中的相关抗原,肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)的纯度。本文采用Waters体积排阻色谱柱(SEC,UltrahydrogelTM 2507.8×300 mm,6μm),流动相为0.01 mol/L的PBS中再加入0.1 mol/L氯化钠溶液,等度洗脱,流速0.3 mL/min,检测波长280 nm,进样量50μL,柱温21℃,进行EV71与CA16病毒原液的纯度检测,并对该方法的检测限、拖尾因子、专属性、重复性及检测范围进行验证。结果显示,2种抗原的灵敏度溶液的信噪比(S/N)分别为37.053和47.710,均远大于3,各试样的拖尾因子均小于3;CA16原液和EV71原液经HPLC分离纯化后的目标抗原峰馏分经SDS-PAGE和Western-Blot特异性鉴定,结果显示,色谱峰样品组成分别为CA16和EV71的2种病毒衣壳的结构蛋白,表明本检测方法专属性高。不同浓度的EV71与CA16病毒抗原经多次检测后,各浓度条件下的峰面积百分比与保留时间的RSD均小于1%,重复性良好。不同抗原浓度批样品检测结果显示,CA16原液抗原浓度在89 U/mL~26398 U/mL之间,EV71原液抗原浓度在170 U/mL~9074 U/mL之间时,2种抗原溶液经多次检测统计显示峰面积百分比与保留时间的RSD均小于1%,本方法在该抗原浓度范围内准确可靠,适用于EV71-CA16二价手足口病灭活疫苗原液中病毒抗原纯度的检测。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16鼠源性广谱中和活性单克隆抗体的制备

目的制备可以同时阻断肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)感染的中和活性单克隆抗体(mAb)。方法采用EV71病毒体蛋白1(VP1)羧基端的163~177位氨基酸(SP55)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备mAb,用EV71中和抗原表位SP55以及高度同源的CV-A16 VP1羧基端的第163~177位氨基酸(PEP55)同时进行检测,筛选同时与EV71和CV-A16发生交叉反应的mAb,并进行体外中和试验检测对EV71和CV-A16的中和作用,并分析mAb的生物学特性。结果筛选获得1株可以同时中和EV71及CV-A16的mAb 6E5,其重链为IgG1亚类,轻链为Kappa链;细胞微量中和实验表明其抗EV71感染的中和效价为1∶128,抗CV-A16感染的中和效价为1∶32。结论成功获得1株能同时中和EV71及CV-A16的广谱中和活性mAb。