EYA1通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞的恶性生物学行为

目的:探讨EYA1(eyes absent 1)通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞的恶性进展及其相关机制。方法:收集2016年6月至2018年6月陆军军医大学附属西南医院全军普通外科中心29例胃癌组织及其癌旁组织标本,采用Wb和q PCR实验检测胃癌组织和癌旁组织中EYA1 mRNA和蛋白的表达水平。人胃癌细胞株SGC-7901培养完成后,采用过表达EYA1质粒或siRNA干扰质粒转染胃癌SGC-7901细胞;分别采用MTT、流式细胞术、划痕愈合和Transwell实验检测胃癌SGC-7901细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。结果:胃癌组织中EYA1 m RNA和蛋白表达水平较癌旁组织均明显降低(P<0.01);过表达EYA1可明显提高SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05)、抑制细胞凋亡(P<0.05)。过表达EYA1可明显促进PTEN的表达、抑制PI3K/AKT通路的激活(均P<0.05或P<0.01);但在PTEN干扰后以上作用均受到了明显抑制(均P<0.05或P<0.01)。结论:EYA1可通过促进PTEN的表达抑制PI3K/AKT信号通路,从而抑制胃癌SGC-7901细胞的恶性生物学行为。

Goldenhar综合征家系的eya1基因突变检测

目的探讨eya1基因在Goldenhar综合征家系中的作用。方法收集1个Goldenhar综合征家系6例成员(患者4例,疑似病人2例)的血样,抽提基因组DNA,然后对eya1基因编码蛋白质的外显子3～18进行PCR扩增,测序分析PCR产物。结果家系中患者和表型正常者有3个已知SNP改变。结论排除eya1基因在该Goldenhar综合征家系中的作用,说明有新的致病基因有待发现。

鳃耳综合征家系EYA1基因一个新的无义突变

目的为一临床诊断为鳃耳综合征的中国家系寻找致病基因及位点。方法首先,在征得家系成员的知情同意后,对所有家系成员进行全面的体格检查,听力学检查和颞骨CT检查;其次,采集所有家系成员静脉血,并运用二代测序对先证者进行全外显子和剪切位点测序,关联相关数据库,并对可疑位点进行Sanger验证。结果该家系3代7人,2人已故,4人符合鳃耳综合征的临床诊断。系谱分析显示,该家系遗传方式为常染色体显性遗传。基因检测显示在所有发病成员的EYA1基因上均发现一个未见报道的杂合突变位点,c.769C>T (p.Gln257*),家系内该变异与耳聋表型共分离,且此突变为无义突变,使257号谷氨酰胺突变成终止密码子,对蛋白质影响较大。根据ACMG指南,该突变为此家系的致病突变,家系中表型正常成员及100名正常人中均未发现这个突变位点。结论本研究为一个临床诊断为鳃耳综合征的家系找到了致病基因和位点,拓展了EYA1基因的突变谱,我们认为将临床症状和基因诊断相结合是综合征性耳聋诊断的要点。

一个鳃-耳-肾综合征家系EYA1基因新致病性变异

目的研究一个鳃-耳-肾综合征(branchio-oto-renal,BOR)家系的临床表型及遗传学特征。方法通过家系调查、临床检查和遗传学特征分析,对一个鳃-耳-肾综合征家系的临床表型及致病原因进行系统研究,提取家系成员的外周血DNA,采用遗传性耳聋基因芯片进行最常见的GJB2(135 del G、176 del 16、299 del AT、235 del C)、GJB3(538 c>T)、SLC26A4(2168A>G、IVS7-2A>G)、mtDNA12SrRNA(1494C>T、1555C>T)4个基因9个耳聋位点检测,利用Sanger法进行基因测序,采用蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen2和REVEL进行变异致病性的预测。结果该家系共有3代9人,4人患病,所有患者均有不同程度的听力损失;先证者(III-3)、其姐姐(III-1)和其母亲(II-2)均有右侧的肾异常;遗传性耳聋基因芯片检测结果未发现最常见的4个耳聋基因突变;Sanger测序法基因检测结果显示,先证者(III-3)、患者II-2、III-1及III-2的EYA1基因c.889C>T(p.R297X)突变,为无义突变,均为杂合变异,变异来源于II-2,II-1(先证者父亲)未发现该位点的变异。利用蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen2和REVEL进行EYA1基因变异致病性的分析,结果均显示为未知。结论本研究首次检测出中国BOR综合征人群中EYA1基因c.889C>T(p.R297X)位点的致病性突变。

Eya1基因在小鼠眼发育过程中功能的初步研究

以Eya1基因的敲除突变小鼠为实验对象,初步研究了Eya1基因在小鼠眼发育中的作用.结果发现,Eya1基因功能完全丧失的敲除突变纯合子(Eya1-/-)胚胎的双侧眼皮均不能融合,27.3%的Eya1+/-胚胎单侧或双侧眼皮不能完全融合;而在Eya1基因有较强表达的其它主要结构如晶状体(lens)、色素视网膜(pigmentalretina)、眼神经(opticnerve)中均未发现异常.结果表明,Eya1为小鼠眼皮融合的决定性基因;而在眼的其它结构的发育中存在与Eya1具有互补作用的基因.

先天性小耳畸形EYA1和SIX1基因检测分析

目的了解先天性小耳畸形患者是否存在EYA1和SIX1基因突变。方法选择先天性小耳畸形患者100例,包括13个家系的先证者和家系其他患病成员共31人及散发患者69人,其中,小耳畸形伴耳前凹34例,小耳畸形伴耳前赘或副耳22例,小耳畸形伴腭裂8例,小耳畸形伴面部不对称21例,单纯小耳畸形15例,通过PCR和直接测序对EYA1和SIX1基因进行突变检测。结果检测到4种EYA1核苷酸改变,分别为258G>A(Q86Q)、813A>G(T271T)、1278C>T(G426G)和1755T>C(H585H)。1例散发患者检测到SIX1外显子1非编码区219位C>T;另2例散发患者SIX1外显子1～28位碱基G缺失。结论本实验未在先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者中发现EYA1和SIX1基因已知热点突变。

Eya1基因S298A突变型过表达慢病毒载体的构建及其对MES23.5细胞凋亡的影响

目的构建小鼠Eya1第298位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)的慢病毒表达载体,并探讨Eya1的298位点突变对MES23.5多巴胺能细胞凋亡的影响。方法采用PCR法、Golden Gate技术和LR反应构建携带Eya1S298A基因的慢病毒重组表达质粒。嘌呤霉素筛选稳定表达Eya1S298A的MES23.5细胞株。将稳定表达Eya1S298A或Eya1的MES23.5细胞经6-羟多巴胺处理2h,构建细胞损伤模型。CCK8法和Western blot法检测298位点突变对细胞活力和Bcl-2蛋白表达的影响。结果测序结果和PCR结果表明Eya1基因的第298位S被突变为A,Eya1S298A基因成功连接于慢病毒载体。CCK8结果表明,Eya1S298A突变组的细胞活力水平明显低于Eya1野生组(P<0.05)。Western blot结果表明,突变组Bcl-2蛋白表达水平明显低于野生组(P<0.05)。结论成功构建含Eya1S298A基因的慢病毒表达质粒,并建立稳定表达Eya1S298A的细胞株;Eya1的298位点突变降低了Eya1对MES23.5细胞的抗凋亡作用。

Eya1基因过表达对MES23.5细胞凋亡的影响

目的构建眼发育缺失1(Eya1)基因慢病毒载体,并探讨过表达Eya1对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的鼠多巴胺能神经元细胞MES23.5凋亡的影响。方法构建过表达Eya1基因的慢病毒,并感染MES23.5细胞,筛选稳定表达Eya1的细胞株;6-OHDA药物处理诱导MES23.5多巴胺能细胞损伤模型,分为对照组、空载体组、过表达Eya1组;采用CCK-8法检测细胞活力、细胞凋亡Hoechst染色(Hoechst 33258)和Western blot检测过表达Eya1对细胞凋亡的影响。结果酶切电泳显示目的基因重组至慢病毒载体,测序结果表明构建的Eya1基因过表达载体与Eya1基因编码序列完全一致;CCK-8显示6-OHDA药物处理后过表达Eya1组的细胞活力水平高于对照组(P<0.05);Hoechst 33258染色显示过表达Eya1组的细胞核浓缩聚集水平低于对照组;且过表达Eya1组中Bcl-2蛋白的表达高于对照组(P<0.05),Bax蛋白的表达低于对照组(P<0.05)。结论成功构建了过表达Eya1的MES23.5细胞株,Eya1通过调控Bcl-2、Bax蛋白表达,从而拮抗6-OHDA诱导的MES23.5多巴胺能细胞的凋亡。

EYA1基因变异的综合征家系临床表型和基因分析

目的:研究一个鳃耳综合征(branchio-oto syndrome)家系临床表型,探寻该家系的遗传学病因。方法:收集1例诊为鳃耳综合征的患儿及家系成员的临床资料,提取先证者及其家系成员的外周血基因组DNA,进行全外显子组测序,并对突变位点进行Sanger测序验证分析。结果:该家系包括2代4人,其中3人有表型,2人听力下降,并且有双侧耳前瘘管,双侧鳃裂瘘,1人双侧耳前瘘,双侧鳃裂瘘,均符合鳃耳综合征的临床诊断,该家系遗传方式为常染色体显性遗传,基因检测显示该家系所有发病成员EYA1基因均有c.1744delC(p.L592Cfs*47)变异,表型正常成员该位点为野生型,家系内符合基因型与表型共分离。该突变为移码突变,导致终止密码子提前出现,该突变目前尚未见报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南,该变异初步判定为疑似致病性变异。结论:该家系新发现的EYA1c.1744delC(p.L592Cfs*47)突变为该家系患者的致病突变基因,进一步拓展了EYA1基因的突变谱,使我们对于该病有了更新的认识,为临床诊断和遗传咨询提供了重要参考。

新发EYA1基因杂合缺失变异所致鳃-耳综合征型耳聋一个家系的遗传学诊断

目的探究1个鳃-耳综合征(BOS)型耳聋家系的基因变异类型,明确可能遗传学病因。方法选取2021年5月于郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心就诊的1个BOS型耳聋家系为研究对象。采集本研究BOS型耳聋家系的临床资料,抽取先证者及其父母的外周血样,提取基因组DNA。应用全外显子组测序(WES)对先证者进行基因检测,应用多重连接探针扩增(MLPA)对测序结果进行家系验证,应用短串联重复序列(STR)分析技术对先证者及其父母进行亲缘关系鉴定,对候选变异进行致病性分析。结果先证者为6岁女性,临床主要表现为内耳畸形合并双侧鳃裂瘘管的先天性重度耳聋。WES检测发现先证者第8号染色体q13.3处存在2466 kb的杂合缺失,该区域覆盖EYA1基因。MLPA检测证实先证者EYA1基因的全部18个外显子均存在杂合缺失,其父母未携带该基因缺失变异,提示为新发变异。STR分析支持先证者与其父母的生物学亲缘关系。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)与ClinGen联合制订的相关指南,该变异被评级为致病性变异(PVS1+PS2+PM2_Supporting+PP4)。结论EYA1基因杂合缺失变异可能是本研究BOS型耳聋家系的遗传学病因,为临床诊断该家系提供参考依据。

两个鳃耳综合征家系的临床表型及致病变异分析

目的探寻两个鳃耳综合征家系的致病原因。方法收集2个家系临床资料,利用全外显子组测序和Sanger测序技术检测和验证鳃耳综合征致病基因和变异。结果2个家系中,先证者1为先天性重度感音神经性听力下降,伴耳前瘘管及颈前瘘管;先证者2在5岁时发现双耳听力下降并渐进性加重,伴耳前瘘管及颈前囊肿,现双耳为重度混合性听力损失;两例先证者均被诊断为鳃耳综合征。基因检测结果示,先证者1携带EYA1基因的无义变异:NM_000503.6:c.1408G>T(p.Glu470Ter),先证者2携带EYA1基因的无义变异:NM_000503.6:c.889C>T(p.Arg297Ter),根据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)指南上述变异均评级为致病变异。c.1408G>T基因变异既往未见报道,c.889C>T基因变异为已知变异。结论EYA1基因的c.1408G>T(p.Glu470Ter)变异和c.889C>T(p.Arg297Ter)变异是本研究两个家系鳃耳综合征的致病原因。

鳃耳综合征EYA1基因新突变的鉴定及遗传学分析

目的通过分析鳃耳综合征患儿及家系成员的临床表现和基因序列,明确其生物学致病原因。方法收集我国云南地区1例鳃耳综合征患儿及家系成员的临床资料,提取先证者及其家系成员的外周血基因组DNA,对406个耳聋相关易感基因全部外显子及其侧翼序列进行高通量测序,并对突变位点进行Sanger测序验证分析。结果该家系包括3代9人,其中4人表现为听力下降、耳前瘘管和鳃裂瘘,符合鳃耳综合征的临床诊断。先证者及其母亲耳廓畸形,内耳发育畸形,肾脏未见异常。系谱分析显示,该家系遗传方式为常染色体显性遗传。基因检测显示在所有发病成员的EYA1基因上均发现一个未见报道的杂合突变位点,c.1255delT(p.C419Vfs*12),家系内该变异与耳聋表型共分离,且此突变为移码突变,导致终止密码子提前出现。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南初步判定为致病性变异,家系中表型正常成员及100名健康人中均未发现该位点突变。家系中3名成员存在EYA1 c.403G>A(p.G135S)杂合突变,该突变导致第135号氨基酸由甘氨酸变异为丝氨酸,为错义突变,其中2名成员表型正常,ACMG指南判定该变异临床意义未明。结论EYA1 c.1255delT是该家系鳃耳综合征患者的主要分子病因,家系内患病个体间临床表现具有异质性,鳃耳综合征的诊断需将表型和基因测序密切结合。

先天性小耳畸形EYA1基因筛查及其启动子区域甲基化研究

目的EYA1基因编码的蛋白质对鳃弓和耳部的正常发育至关重要,本研究选择EYA1基因作为候选基因对先天性小耳畸形患者进行突变检测,并对其启动子区域CpG岛甲基化状态进行研究。方法研究对象选择先天性小耳畸形患者100例,其中包括13个家系(先证者和家系其他患病成员共31人),散发患者69人。通过PCR和直接测序对EYA1基因进行突变检测。并应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测了病例组和正常对照的EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化情况。结果检测到4种EYA1核苷酸改变,分别为258G>A(Q86Q)、813A>G(T271T)、1278C>T(G426G)和1755T>C(H585H)。先天性小耳畸形患者EYA1基因的CpG_Unit3和CpG_Unit5甲基化程度分别为0.09258±0.033846和0.0922±0.02379,与正常对照相比明显降低,其差异具有统计学意义。结论本实验未能在先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者中检测到EYA1基因的突变,考虑EYA1基因突变可能不是中国人群先天小耳畸形的主要致病原因。先天性小耳畸形存在EYA1基因低甲基化情况,可能与该病的发生发展相关。

一个EYA1基因无义变异所致鳃-耳综合征家系的遗传学分析

目的探讨1个疑似鳃-耳综合征家系的临床表型,寻找该家系的可能致病原因,为其临床诊断提供依据。方法应用目标序列捕获技术对先证者进行耳聋基因的筛查,找到可疑致病变异,并用Sanger测序对家系成员进行验证。结果遗传性耳聋基因筛查检测到先证者EYA1 c.1627C>T(p.Gln543Ter)无义变异;Sanger测序证实该家系中4例有鳃-耳综合征临床表型的患者均系EYA1 c.1627C>T(p.Gln543Ter)变异杂合子。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,EYA1 c.1627C>T(p.Gln543Ter)变异判定为致病性变异(PVS1+PS+PP3+PP4)。结论EYA1基因c.1627C>T(p.Gln543Ter)变异可能为该家系患者的致病原因,基因检测结果可以为其临床诊断提供依据。

Eya1-Six1信号在斑马鱼侧线神经丘毛细胞再生过程中的表达

机械感觉毛细胞对于脊椎动物的听力和平衡能力至关重要，低等脊椎动物毛细胞在遭受损伤后具有很强的再生能力。鱼类侧线神经丘毛细胞与内耳毛细胞具有相似的结构、功能、发育和再生过程。我们将受精后5~6 d的斑马鱼仔鱼置于400 μmol/L新霉素溶液中处理1 h破坏神经丘毛细胞。分别对处理后2、4、8、12及24 h的斑马鱼仔鱼进行组织学切片及功能基因eya1和six1b的整体原位杂交。组织学切片结果显示：对照组神经丘毛细胞与支持细胞形态及排布都很规则，毛细胞和支持细胞分别位于上层和下层；处理后2~4 h，上层毛细胞数量显著下降；处理后8~12 h，支持细胞和毛细胞之间界限模糊，部分支持细胞变长，且与基膜脱离；处理后24 h，部分神经丘内毛细胞及支持细胞数量、形态及排布接近对照组水平。整体原位杂交结果显示：eya1和six1b在对照组斑马鱼仔鱼整个神经丘都有表达；处理后4 h内神经丘中央毛细胞中eya1和six1b的表达量显著下降，周围的支持细胞中仍保持一定量的表达；这两个基因的表达量从处理后8 h起逐渐提高，在处理后12~24 h恢复甚至超过对照组。综上结果表明：神经丘毛细胞再生过程中可能有支持细胞的参与，且重启了神经丘毛细胞发育过程中的功能基因eya1和six1b。

鳃-耳-肾综合征家系EYA1基因一个新的外显子重复变异

目的:为一临床诊断为鳃-耳-肾综合征的中国家系寻找致病基因及位点。方法:回顾性分析1个鳃-耳-肾综合征核心家系的临床特征及治疗经过;应用全外显子测序技术(WES)对先证者进行全外显子水平突变分析,其中部分外显子缺失/重复利用荧光定量PCR方法(Realtime-PCR)验证。结果:该家系中先证者,男,4岁1个月,有耳聋、内耳和中耳结构畸形、耳前瘘管、鳃裂瘘管和肾萎缩临床表型,符合鳃-耳-肾综合征的临床诊断,父、母均无类似表型。WES检测及荧光定量PCR验证发现患者EYA1基因外显子13~18存在单倍重复,其父母未见异常。外科手术切除双侧耳前及鳃裂瘘管,术后恢复较好,佩戴助听器辅助听力。结论:本研究寻找到一种新的EYA1基因外显子重复变异致鳃-耳-肾综合征,拓展了EYA1基因的突变谱。

先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域甲基化初步研究。

目的探讨先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化状态。方法应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测了64例先天性小耳畸形患者和36例健康对照的EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化情况。结果先天性小耳畸形患者EYA1基因的CpG—Unit3和CpG—Unit5甲基化程度分别为0．09258±0．033846和0．0922±0．02379，与健康对照相比明显降低，其差异具有统计学意义（P=0．001和0．019）。结论先天性小耳畸形存在EYA1基因低甲基化情况，可能与该病的发生发展相关。

鳃-耳-肾综合征1例并文献复习

1病例资料患者男,8岁,以“出生后双耳听筛未通过、双侧耳廓畸形、右侧渐进性周围性面瘫”入院。患儿自出生后行双耳听筛未通过,1岁左右可以正常学习说话,家长未进一步评估其听力情况,2年前上学后家长及老师发现患儿双耳听力明显弱于正常儿童,同时右侧周围性面瘫渐进性加重。专科查体:双侧杯状耳,右侧耳屏前见副耳,双侧耳轮脚前方各见一瘘孔,周围皮肤正常,无异常分泌物。左侧外耳道狭窄,右侧正常,双侧鼓膜完整,标志清。音叉RT:BC>AC;WT→R。

鳃-耳-肾综合征1例

鳃-耳-肾综合征是一种较为罕见的常染色体显性遗传性疾病。其临床表现主要为耳部畸形、鳃裂异常和肾发育异常。本例患者在我院2018年12月接受人工耳蜗植入,现将其诊疗过程,及术后效果报道如下。1简要病史患儿,女,1岁2个月,因听筛未过入院。确诊双耳极重度感音神经性聋8个月。出生发现左侧颌下肿物伴右侧瘘口,有分泌物挤出。

鳃耳肾综合征临床特点与遗传学的研究进展

耳聋是一种常见的公共健康问题,对社会经济造成极大损失。鳃耳肾综合征(BORS)是常染色体显性遗传性综合征型耳聋疾病,在人群中的发病率约为1/40 000,而在聋哑儿童中的发病率约为2%。国内对BORS的研究报道较少,如对该综合征没有充分的认识,易忽略相关临床表现的联系而将该类患者诊断为单纯性耳聋、耳前瘘管或鳃裂瘘等。本文主要对该病的临床特点、治疗现状及遗传学研究进展作一综述。