小麦E3泛素连接酶TaRING1互作靶标筛选与验证

【目的】为探究TaRING1在小麦与条锈菌互作过程中的作用,解析其作用机理,为小麦条锈病的绿色防控提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交技术筛选TaRING1的互作靶标蛋白,并通过荧火素酶互补实验(LCA)及双分子荧光互补(BiFC)验证互作,通过泛素化实验对TaRING1的泛素功能进行验证,通过烟草瞬时表达及小麦原生质体转化分析靶标TaRIP92的亚细胞定位。【结果】以TaRING1作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选到互作靶标TaRIP92,并通过LCA及BiFC验证TaRING1与TaRIP92互作,通过体外泛素化实验证明TaRING1可以泛素化底物TaRIP92,烟草瞬时表达及小麦原生质体转化发现TaRIP92蛋白定位于线粒体。【结论】TaRING1通过与线粒体蛋白TaRIP92互作并对其进行泛素化。

水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。

甜菜应答盐胁迫的E3泛素连接酶UPL家族基因的鉴定与分析

甜菜为二年生草本植物,是我国重要的糖料作物,广泛种植于我国东北、西北和华北等地区。本文以甜菜T710-Mu品系为试验材料,利用盐胁迫下的甜菜转录组数据库,通过建立隐马尔科夫模型筛选数据库得出3个响应盐胁迫的含有HECT结构域的UPL(Ubiquitin-protein ligase)家族基因。对3个UPL家族基因编码的蛋白质BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5进行蛋白质理化性质预测、进化关系分析、蛋白质保守结构域分析和蛋白质互作网络等生物信息学分析。预测BvUPL3、BvUPL4和BvUPL5分别分布在Chr09、Chr07和Chr08,并且具有典型的HECT型结构域,鉴定得到的编码E3泛素连接酶UPL基因属于UPL家族基因。蛋白质互作预测结果表明,这些UPL蛋白质之间存在相互作用,并可能与泛素蛋白酶体系统中其他组分,如泛素藕合因子、E2共价结合酶以及26S蛋白酶体等相互影响。结合荧光定量PCR和转录组数据结果可知,BvUPL3基因在叶片和根部的相对表达量与对照组相比显著上升,BvUPL4和BvUPL5基因的相对表达量与对照组相比在叶片中显著下调,在根部显著上升,这些结果可为后续深入研究甜菜泛素连接酶提供理论基础。

E3泛素连接酶在结直肠癌中的作用机制研究进展

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一,其致病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。泛素化在CRC的发生发展过程中扮演重要角色,其调控作用主要依赖于E3泛素连接酶泛素化修饰底物蛋白使之活性改变或发生泛素—蛋白酶体降解。该文就RING(really interesting new gene)型和HECT(homologous to E6AP C-terminus)型E3泛素连接酶在CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及化疗敏感性中的作用机制及这两类E3泛素连接酶的靶向抑制剂相关研究进展作一综述,为CRC致病机制研究及其靶向治疗提供新的思路。

大豆E3泛素连接酶基因GmHOS1a和GmHOS1b生物信息学分析和敲除载体构建

HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLLY RESPONSIVE GENES 1(HOS1)是植物中多种信号途径的整合因子,在植物发育、胁迫反应、光形态建成和开花调控中发挥至关重要的作用,是很有潜力的作物工程育种目标基因,但其在大豆中的功能尚未被揭示。为了揭示其在大豆中的功能,本研究利用反向遗传学,成功克隆了两个大豆HOS1基因,GmHOS1a和GmHOS1b,并通过生物信息学技术,对其蛋白结构、表达模式和功能进行了分析。进化树和结构域分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b具有N端的环指结构域和与ELYS高度相似的保守基序,与拟南芥和水稻HOS1蛋白高度同源。亚细胞定位结果显示,GmHOS1a和GmHOS1b定位在细胞核中。Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)结果表明,GmHOS1a和GmHOS1b的基因表达模式相似,均在三出复叶中高度表达。48 h光周期RNA-sequencing(RNA-seq)和qRT-PCR分析表明,GmHOS1a和GmHOS1b基因的表达具有生物钟昼夜节律性,其中GmHOS1a的表达量显著高于GmHOS1b,GmHOS1a见光后表达量升高,黑暗前表达量达到峰值。为进一步探索GmHOS1a和GmHOS1b蛋白的功能,利用CRISPR/Cas9系统构建了9个GmHOS1a和GmHOS1b基因敲除载体,通过发根检测实验,筛选出6个高效工作载体,可供后续遗传转化实验使用。本研究为阐明该基因的功能和作用机理奠定了理论基础,并提供了可供遗传转化的载体材料。

miR-146b-5p靶向E3泛素蛋白连接酶促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化

目的探讨miR-146b-5p与E3泛素蛋白连接酶(ZNRF3)对高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮间质转化(EMT)进程的影响及作用机制。方法正常培养的小鼠为对照组,采用4.25%葡萄糖透析液和0.1 mg/kg的脂多糖诱导腹膜纤维化小鼠模型,收集小鼠腹膜组织,Masson染色观察腹膜组织胶原纤维变化,免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(COL I)表达。Western blot检测腹膜组织上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、α-SMA和COL I表达。qRT-PCR检测腹膜组织中miR-146b-5p和ZNRF3表达。双荧光素酶报告基因检测验证miR-146b-5p和ZNRF3靶向关系。分离对照组小鼠腹膜间皮细胞,高糖诱导构建小鼠腹膜间皮细胞纤维化模型,将细胞分为对照组、模型组、mimic-NC组、miR-146b-5p-mimic组和miR-146b-5p-inhibitor组。Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力。Western blot检测EMT相关蛋白表达。结果与对照组小鼠比较,模型组小鼠腹膜组织增厚,胶原纤维增多,α-SMA和COL I表达增加(P<0.05),miR-146b-5p表达升高(P<0.05),E-cadherin和ZNRF3表达降低(P<0.05)。miR-146b-5p靶向负调控ZNRF3表达。细胞水平检测结果显示,与对照组比较,模型组和mimic-NC组小鼠腹膜间皮细胞迁移和侵袭细胞数增多(P<0.05),E-cadherin表达降低(P<0.05),波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-146b-5p-mimic组小鼠腹膜间皮细胞变化趋势更为显著,miR-146b-5p-inhibitor组细胞EMT进程受到抑制。结论miR-146b-5p可靶向ZNRF3基因促进高糖诱导的小鼠腹膜间皮细胞EMT进程。

青花菜E3泛素连接酶基因的克隆及表达分析

为探讨泛素蛋白酶体在高温胁迫下参与蛋白质降解途径相关的生理过程和功能,以青花菜‘KUQ19⁃27’为试验材料进行高温胁迫(38℃)处理,设计特异性引物从青花菜中克隆得到青花菜E3泛素连接酶基因并进行生物学信息分析,并运用实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.结果显示:E3泛素连接酶基因的ORF长度为1332 bp,编码443个氨基酸,相对分子量为48.3 kD.亲疏水性分析结果表明:在多肽链中第207位氨基酸时,亲水性最高,为3.38;在肽链中第280位氨基酸时,疏水性最高,为-4.23,是疏水性蛋白.在青花菜E3泛素连接酶基因氨基酸序列中,其C、Y、S值均小于0.5,由此预测其不具有信号肽,不属于分泌蛋白.系统进化分析表明青花菜E3泛素连接酶基因与其他物种,比如拟南芥、草莓、月季、葡萄等苷核酸序列相似性都在60%以上,同甘蓝、油菜、白菜和拟南芥的进化关系较近,同草莓、月季、菜豆、葡萄、刺菜蓟、芝麻和水桔梗的进化关系较远,与其他物种,如拟南芥、草莓、月季、葡萄等核苷酸序列相似性都在60%以上.荧光定量PCR技术结果表明高温处理3 h时,青花菜E3泛素连接酶基因表达量下调30%,胁迫12 h时表达量持续下降仅为对照的20%.研究结果可为进一步深入探讨青花菜E3泛素连接酶的高温胁迫响应机制提供一定的理论依据.

‘无子瓯柑’E3泛素连接酶基因CsRNF217对转基因烟草育性的影响

【目的】为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima‘Seedless’E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响,采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum,分析其对烟草育性的影响。【方法】采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性,利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T1阳性株系花药中的表达强弱。【结果】‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T1株系中高效表达,转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。【结论】过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降,同时伴随胚囊育性下降的现象,推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。

E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用

目的 探讨E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用及机制。方法 构建髓系细胞中特异性敲除E3蛋白泛素连接酶WWP1基因的小鼠,检测WPP1基因是否被敲除,随后进行分组,分为WWP敲除组(WWP1^(+/+))和WWP未敲除组(WWP1-/-),两组小鼠再分别喂养菊聚糖硫酸钠(DSS)建立炎症性肠病模型(DSS组)和喂养生理盐水(无菌水组),每组小鼠共10只,喂养7 d,每天检测小鼠结肠炎的临床症状,结束后处死小鼠,测量结肠长度,评估小鼠结肠炎损伤情况,Elisa检测小鼠结肠黏膜组织炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α水平,采用RT-qPCR和Western blot检测TLR4表达水平。同时使用基因沉默方法敲除RAW 264.7细胞的WWP1基因,使用LPS刺激构建结肠炎症情况下的巨噬细胞环境,检测WWP1+组与WWP1-组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和TLR4、WWP1表达水平。结果 WWP1^(+/+)组和RAW264.7细胞沉默组中WWP1-mRNA表达均明显下调,提示成功敲除WWP1基因。DSS组WWP1-/-小鼠体质量减轻程度明显大于DSS组WWP1^(+/+)小鼠,DSS组WWP1-/-小鼠的DAI值明显大于DSS组WWP1^(+/+)小鼠,DSS组WWP1^(+/+)小鼠结肠长度明显长于DSS组WWP1-/-小鼠;与WWP1-/-相比,WWP1^(+/+)的小鼠组织病理损伤程度更轻,结肠炎的症状更轻,同时小鼠IL-6、TNF-α表达水平明显更低,IL-10表达水平明显更高,炎症损伤程度更轻,RT-qPCR和Western blot检测结肠组织和细胞中TLR4的表达也显示,与WWP1-/-相比,WWP1^(+/+)的小鼠TLR4表达水平明显更低,在细胞株中,WWP1+组TLR4表达水平明显更低(P<0.05)。结论 E3蛋白泛素连接酶WWP1可以对炎症性肠病中炎性聚集起到保护作用,这种保护作用的发挥可能是通过TLR4通路实现的。

E3泛素连接酶的结构功能及其在肿瘤中的最新研究进展

E3泛素连接酶是泛素-蛋白酶体系统中不可缺少的一大类酶,根据催化核心结构域可分为HECT E3s、 U-box E3s、RING E3s三大家族,其中RING E3s又可分为TRIM、PA-TM-RING、RBR、MARCH和UIM五个家族。真核生命的一切生物行为都离不开泛素的修饰,而E3泛素连接酶则通过介导泛素-E2泛素连接酶将泛素传递给靶蛋白,能严格控制泛素化反应。因此,E3泛素连接酶可能参与调节细胞增殖等生物过程和细胞对与癌症发展相关的应激信号的反应,可以成为多种癌症治疗的有希望的靶点。因此,本文对E3泛素连接酶的分类、功能及在肿瘤中的作用进行综述。

泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

无齿E3泛素蛋白连接酶同源物在恶性肿瘤中的研究进展

无齿E3泛素蛋白连接酶同源物(DTL)是E3泛素连接酶中重要的底物适配器,主要通过介导染色质许可和DNA复制因子1(CDT1)、SET结构域赖氨酸甲基转移酶8(SET8)和p21参与蛋白质的泛素化和降解,并调控细胞周期和基因组的稳定性。目前的研究发现,DTL在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用,如乳腺癌、肝细胞癌和宫颈癌等,且与患者预后具有显著相关性。本文就DTL的基本功能及在乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌和恶性黑色素瘤中的研究进展进行综述。

E3泛素连接酶ARIH1功能的研究进展

ARIH1是一种新发现的E3泛素连接酶,属于RBR家族,具有多种生物学功能,并与许多疾病的发生发展密切相关,如参与调控癌组织的进展,抑制细菌病毒等的增殖,调节代谢等,但仍有很多功能及机制有待研究人员去挖掘和探索。文章旨在对近年ARIH1蛋白的功能研究进展进行综述,为研究人员提供可能的研究方向和目标。

无齿E3泛素蛋白连接酶同源物在食管鳞状细胞癌中的表达及与预后的关系

目的探讨无齿E3泛素蛋白连接酶同源物(DTL)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达及与预后的关系。方法收集TIMER2数据库资料,分析DTL在食管癌组织中的mRNA表达水平。采用免疫组化染色法检测95例ESCC组织和癌旁正常组织中DTL的蛋白表达情况,分析DTL表达情况与ESCC患者临床特征的关系,并分析ESCC患者预后的影响因素。结果TIMER2数据库分析结果显示,食管癌组织中DTL mRNA表达水平高于正常食管组织,差异有统计学意义(P﹤0.05)。ESCC组织中DTL阳性表达率为56.8%(54/95),明显高于癌旁正常组织的35.8%(34/95),差异有统计学意义(P﹤0.01)。不同病灶数目及组织学分级ESCC患者的ESCC组织中DTL表达情况比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。DTL阳性表达的ESCC患者总生存期明显短于DTL阴性表达患者,差异有统计学意义(P﹤0.01)。多因素分析结果显示,DTL阳性表达是ESCC患者预后的独立危险因素(P﹤0.01)。结论DTL在ESCC中高表达,且与ESCC的发生发展密切相关,可能是ESCC潜在的预后分子标志物。

E3泛素连接酶RFWD家族成员在肿瘤中的作用研究进展

环指和WD重复结构域(RING Finger and WD Repeat Domain,RFWD)蛋白属于E3泛素连接酶,在细胞增殖、凋亡和DNA损伤修复的调控中发挥重要作用。越来越多的证据表明,RFWD蛋白通过靶向其底物泛素化降解参与肿瘤的发生发展。RFWD蛋白在不同类型的人类恶性肿瘤中具有抑癌和促癌的不同作用,可能与其底物蛋白的功能有关。本文分析了RFWD蛋白家族成员(RFWD1,RFWD2,RFWD3)的结构和功能,总结了RFWD蛋白家族成员的已知底物,并阐明其在不同肿瘤中的不同功能。此外,本文还讨论了RFWD家族成员作为癌症治疗潜在靶点的可能及策略。

泛素连接酶和去泛素化酶在帕金森病中的作用

中脑黑质多巴胺能神经元特异性损伤和α突触核蛋白聚集的分子机制是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)研究领域亟待解决的问题。蛋白质异常聚集很大程度上是由于泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)功能障碍引起的。蛋白质泛素化由一系列泛素化酶级联反应促进,并受去泛素化酶(deubiquitylases,DUBs)的反向调节。泛素化和去泛素化过程异常导致蛋白质异常聚集和包涵体形成,进而损伤神经元。近来研究报道,蛋白质的泛素化和去泛素化修饰在PD的发病机制中发挥重要作用。E3泛素连接酶促进蛋白质的泛素化,有利于α突触核蛋白的清除、促进多巴胺能神经元的存活、维持线粒体的功能等。DUBs可以去掉底物蛋白质的泛素化修饰,抑制α突触核蛋白的降解,调控线粒体的功能和神经元内铁的稳态。本文以E3泛素连接酶和DUBs为切入点,综述了蛋白质泛素化和去泛素化修饰参与多巴胺能神经元损伤机制的最新研究进展。

拟南芥中RING型E3泛素连接酶基因AtGW2的克隆和功能分析

水稻R ING型E3泛素连接酶基因O sGW2在调控水稻产量性状方面起着十分重要的作用。根据O sGW2的cDNA序列,通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了一个与O sGW2同源的基因,命名为AtGW2。序列分析表明,该基因编码一个R ING-C2型E3泛素连接酶蛋白,含有401个氨基酸。通过构建AtGW2RNA干扰植物表达载体并转化拟南芥,结果表明,获得的转基因后代植株的子粒较野生型大,并且转基因拟南芥子粒千粒重高于野生型,这表明AtGW2负调控拟南芥子粒大小及粒重。

向日葵E3泛素连接酶基因克隆及表达分析

该研究从向日葵中克隆了E3泛素连接酶基因HERC2,并进行了生物信息学分析和不同胁迫条件的表达分析。序列分析表明,HERC2(登录号为KT832066)序列的CDS为1 608bp,编码535个氨基酸,预测其分子量131kD,等电点为5.03。HERC2编码的蛋白质为疏水性蛋白质,且为细胞质蛋白;亚细胞定位预测分析表明,向日葵HERC2可能定位在高尔基体中;该蛋白质有5个RCC1保守结构域。向日葵HERC2与已报道的其他植物同源蛋白有相似的保守区域,与醉蝶花亲缘关系最近,而与大豆和野生大豆的亲缘关系最远。与HERC2cDNA对应的gDNA(登录号为KT832067)的ORF长度为3 409bp,与cDNA编码序列比对结果表明,该gDNA由5个外显子和4个内含子组成。实时荧光定量PCR分析表明,向日葵HERC2基因表达受非生物胁迫调节,在不同器官及不同非生物胁迫下存在特异性表达差异。研究认为,HERC2基因应答逆境胁迫具有其特定的表达模式,研究结果为加强对HERC2的利用奠定了基础。

乳腺癌中泛素蛋白连接酶E3A与泛素特异性蛋白酶25的表达及其临床意义

目的探讨泛素蛋白连接酶E3A(ubiquitin protein ligase E3A,UBE3A)与泛素特异性蛋白酶25(ubiquitin specific protease 25,USP25)在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性,并分析UBE3A与USP25在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中的关系。方法采用免疫组织化学染色检测50例乳腺癌组织及癌旁相对正常组织石蜡标本中UBE3A与USP25的表达情况,并分析它们与乳腺癌患者临床病理特征的关系;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞,通过荧光定量PCR与Western Blot检测UBE3A基因及蛋白的敲减水平,然后观察敲减UBE3A后USP25的表达水平。结果UBE3A与USP25在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为64%、72%,而在邻近相对正常组织中的表达均为阴性,两者在乳腺癌组织与相对正常组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.001);UBE3A的表达与淋巴结转移(P=0.001)、Ki-67的表达(P<0.001)相关,USP25的表达与组织学分级(P=0.046)、淋巴结转移(P=0.041)、Ki-67的表达(P=0.029)相关;shRNA-UBE3A慢病毒转染乳腺癌MCF-7细胞后,UBE3A蛋白及mRNA的表达均明显降低(P<0.001),且敲减UBE3A后USP25的蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.001)。结论UBE3A与USP25和乳腺癌细胞的增殖、转移等生物学行为相关,在乳腺癌泛素蛋白酶体系统中UBE3A与USP25功能作用明显增强且保持动态平衡,它们可能共同作用促进乳腺癌的的发生发展。

泛素连接酶E3

蛋白质的泛素化修饰具有高度的特异性,它参与调节细胞内许多的生理活动。蛋白质的泛素化修饰涉及一系列的酶参与反应,包括泛素激活酶E1、结合酶E2以及连接酶E3。而其中泛素连接酶E3对靶蛋白的特异性识别起关键作用。泛素连接酶E3主要由HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box结构域家族组成。现对泛素连接酶E3的分类、结构及其对靶蛋白的识别机制等进行综述。