伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病病毒 (Pseudorabiesvirus,PRV)Ea株 gD基因BamHI 6 6Kb片段的重组质粒 pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段 ,并对上游片段进一步改造 ,去掉 gD基因上游的非编码序列 ,构建了含完整 gD基因编码区的重组质粒 pBRgDI,并利用基因内部的限制性内切酶位点 ,用内切酶KpnI和SalI酶切分析 ,证实了 gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒 pSKgDSB和 pSKgDS ,并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较 ,发现Ea株 gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变 ,在编码氨基酸残基水平上也有差异。

伪狂犬病病毒Ea株UL54基因的克隆与序列分析

根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,序列分析结果表明Ea株UL5 4基因全长 10 86bp ,可编码 36 1个氨基酸。由二级结构预测数据推断C 末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL5 4基因进行同源比较 ,发现Ea株UL5 4基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变 ,但无插入或缺失突变 ;将Ea株UL5 4氨基酸序列同其它 4种α 疱疹病毒 (HSV 1、HSV 2、VZV、EHV 1)进行同源比较 ,同源性分别为 47%、36 %、36 %和 44 %。

伪狂犬病病毒Ea株TK^-/gE^-/gp63^-突变株的构建及其生物学特性研究

Using pseudorabies virus Ea strain as material,we inserted LacZ gene expression cassette into gE gene.After blue plaque and plaque purification,a recombinant virus PRVEa TK+-/gE+-/LacZ++ generated.Utilizing EcoR I site in LacZ gene, digested PRVEa TK+-/gE+-/LacZ++ genome DNA was cotransfected into PK-15 cells with plasmid pFBBS,then PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- generated after plaque purification.Four pairs of primers amplification demonstrated the virus was pure TK+-/gE+-/gp63+- mutant virus.PCR product sequence indicates there were 205bp deletion in TK gene;1247bp deletion in gE,gp63 and intergenic region of PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- mutant virus genome DNA.Inoculation to Balb/C mice with PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- indicates the virulence is reduced greatly.

伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原 ,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原 ,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中 ,得到的重组表达载体转化GS1 1 5酵母 ,通过G41 8抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母 ,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白 ,并分泌到胞外。Westernblotting分析显示表达的蛋白大小为3 3kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性 ,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体 。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了 2个利用人类巨细胞病毒 ( HCMV)的启动子启动表达伪狂犬病病毒 Ea株糖蛋白 g D基因的真核表达质粒 p CIDI和 pc DDI,体外转染 BHK-2 1细胞 ,用间接免疫荧光法检测 ,证实糖蛋白 g D在细胞中得到表达。用表达质粒 p CIDI和 pc DDI作为核酸疫苗免疫 BALB/c小鼠 ,ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体 ,结果其滴度为 1∶ 1 2 8～ 1∶ 51 2。初步证实 ,用 g D基因作为核酸疫苗免疫动物 。

抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。

伪狂犬病病毒Ea株gM和gN基因的克隆与结构分析

gM和gN是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒 (PRV)第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列 ,设计两对分别包含gM和gN完整编码区的特异性引物 ,以PRV国内地方分离株 (Ea株 )的细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.2kb和 0 .3kb的特异性片段。将扩增产物克隆到杆状病毒转座载体pFastBacl中 ,酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明 :Ea株gM、gN基因分别编码 394和 98个氨基酸 ,与Ka株的同源性分别为 98.4 %和 97.6 %。DNATool和DNASIS软件对gM、gN进行二级结构预测 ,发现gM存在 8个潜在跨膜区和一个N_糖基化位点 ,是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白 ;gN具有N_端信号肽序列、C_端跨膜区和潜在 0_糖基化位点 ,属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、gN的相互作用位点及二聚体的功能奠定了基础。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gK基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

根据伪狂犬病病毒 (PRV) Ka株序列 ,合成 1对包含 g K基因完整编码区的引物 ,以 PRV Ea株 Bam H 5′片段为模板 ,扩增出 0 .9kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到 p Bluescript SK+ 中 ,构建了重组质粒 p SKg K,用双脱氧末端终止法进行序列测定 ,并同国外 Ka株进行比较。结果表明 ,Ea株 g K基因全长 939bp,编码 313个氨基酸 ,与 Ka株比较 ,Ea株 g K基因有 2 2处点突变 ,但无插入突变和缺失 ,同源性达 97.78%。将 g K基因克隆到原核表达载体p GEX- 2 T中 ,构建了 g K全基因原核表达载体 p2 Tg K939。再用 Bam H 、Xho 酶切 p2 Tg K939,回收 5 88bp g K小片段 ,克隆到原核表达载体 p GEX- KG中 ,构建了 g K部分基因原核表达载体 p KGgk5 88。经 IPTG诱导 ,g K全基因不表达 ,而 g K部分基因表达约 4 0 0 0 0融合蛋白。用 PRV高免血清经 Western blotting证明 ,g K有免疫原性。提取 g K包涵体并制备高免血清 ,EL ISA检测抗体效价为 1∶ 6 4

逆转录病毒介导的PrVEa株gD基因转基因细胞系的建立

采用逆转录病毒介导的方法,将PrVEa株gD基因整合进PK 15细胞染色体中,建立起表达gD蛋白的细胞系PKD。通过荧光观察,发现PKD表达的gD分布在细胞膜上,具备原有的免疫反应性;同时,还发现gD蛋白在PKD细胞膜上呈明显极性分布。PCR技术和间接免疫荧光染色法对PKD进行检测的结果表明该细胞系具有良好的遗传稳定性。在相同培养条件下,PKD细胞的生长速度及形态与正常PK 15细胞无明显差异。用脂质体介导的方法,将PrVEa株基因组转染PKD细胞,在转染后30h细胞发生典型病变,表明PKD细胞对脂质体的毒害具有耐受性。TCID50测定结果显示:PKD对PrVEa株增殖尽管有明显的抑制作用,但PrVEa株仍能在其上正常增殖。上述研究结果提示:所构建的细胞系PKD可用于构建PrVEa株gD基因缺失毒株,为PrVEa株gD基因缺失毒株的构建提供了必备的工具。

伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3.76 kb的基因组片段,该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列.UL31、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.5%~73.4%,偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率最高,占氨基酸残基总数的36.4%.PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98%以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95.7%和94.8%.UL31基因在疱疹病毒α-亚科所有成员之间都很保守,并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高.UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高.UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamHI7片段的质粒pUC6.6进行亚克隆 ,构建了仅含Us9基因约 0 .6kb片段的重组质粒pSKMN0 .6。双脱氧末端终止法进行双链测序 ,结果表明 :Us9存在 2种可能的同C_末端的编码形式 ,分别编码 10 6或 98个氨基酸残基 ,Us9基因与其下游的Us2 (2 8K)基因之间存在约 2 0 0bp的非转录区。将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行同源比较 ,Ea株Us9基因存在多处点突变 ,但总的同源性达 96%。将推导的氨基酸序列与人单纯疱疹病毒I型 (HSV_1)Us9进行比较 ,发现二者在组成和结构上存在多处保守序列 ,尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点 ,C_端疏水性氨基酸以及由连续 6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列 。

伪狂犬病病毒Ea株UL54基因在BHK-21细胞上的表达

以伪狂犬病病毒Ea株BamHI5’片段为模板 ,PCR扩增出约 1.1kbUL5 4基因完整编码区片段 ,将该基因克隆到pB1uescriptIISK+ 中 ,构建重组载体pSKUL5 4。进一步将该片段插入真核表达载体pEGFP_C1的增强绿荧光蛋白EGFP下游 ,构建真核表达载体pEGFPUL5 4,脂质体法转染BHK_2 1细胞 ,G418加压筛选至正常细胞完全死亡 ,在倒置荧光显微镜下观察 ,可见pEGFPUL5 4和pEGFP_C1均发出较强荧光 ,pEGFP_C1转染的细胞在整个细胞发出荧光 ,而pEGFPUL5 4转染细胞在细胞核中发出很强的荧光 ,证明UL5 4基因在BHK_2 1细胞上获得了表达 。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。

伪狂犬病毒诱导感染乳仔猪扁桃体淋巴细胞发生凋亡

将伪狂犬病毒Ea株,按100 TCID50的剂量感染15日龄的健康乳仔猪,所有实验组仔猪在接种后5～7天出现伪狂病症状,取感染组及对照组仔猪扁桃体,进行透射电镜观察、原位末端脱氧核苷酸标记等试验.透射电镜观察发现扁桃体的淋巴细胞发生凋亡,DNA原位末端脱氧核苷酸标记(TUNEL)呈阳性.

解淀粉芽胞杆菌EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果

为明确解淀粉芽胞杆菌Bacillus amylolyticus EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果,室内测定EA19菌株及其发酵液对小麦赤霉病菌Fusarium asiaticum菌落生长、孢子萌发、子囊壳形成的影响,以及在室内离体麦穗上的防治效果,并进行了田间小区防治试验。室内试验测定结果表明,EA19菌株发酵液对小麦赤霉病菌菌落生长和分生孢子的萌发具有显著的抑制作用,在室内离体麦穗上的防治效果可达80.0%,对子囊壳形成无显著影响。田间小区防治试验结果表明,在添加紫外保护剂抗坏血酸的条件下,EA19菌株发酵液和菌体悬浮液对赤霉病均有显著的防治效果,其中EA19菌株发酵液的防治效果可达81.2%。EA19菌株喷雾粉可湿性粉剂对赤霉病的防治效果可达67.4%,能使小麦籽粒中脱氧镰刀菌烯醇毒素含量显著降低36.8%,与50%多菌灵可湿性粉剂的效果无显著差异。表明EA19菌株在生产上防治赤霉病具有较大的开发应用潜力。

乌司他丁抑制TNF—α诱导血管内皮细胞高通透性的研究

目的探讨乌司他丁（UTI）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的血管内皮细胞高通透性的影响。方法建立人脐静脉内皮细胞系EA．hy926细胞TNF-α诱导炎症模型，将其分为正常组、TNF-α组、uTI组及TNF-α＋不同浓度的UTI组（T＋U组），分别采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测EA．hy926细胞活性，EVOM法测单层细胞电阻。RT-PCR法、免疫细胞化学法检测血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）的表达。结果与正常组相比，TNF-α作用下EA．hy926单层细胞电阻值明显降低（67．200±8．937vs33．600±8．771，P=0．010），通透性增加，UTI在1-100U／mL范围内以剂量依赖性方式改善TNF-α所致的EA．hy926细胞高通透性（40．133±7．484vs33．600±8．771，P=0．382；49．232±3．162vs．33．600±8．771，P=0．044；63．700±8．515vs．33．600±8．771，P=0．013）。TNF-α作用下EA．hy926细胞VE-cadherinmRNA的表达较正常组显著降低（1．089±0．018vs0．835±0．021，P=0．000），UTI可抑制TNF-α引起的VE-cadherin低表达，其中UTI浓度为10U／mL和100U／mL时VE-cadherin mRNA的表达较TNF-α．组差异具有统计学意义（0．976±0．014vs．0．835±0．021，P=0．001；1．115±0．015vs．0．835±0．021，P=0．000），UTI的上述作用在1-100U／mL浓度范围内呈现出剂量依赖性。免疫细胞化学结果显示，与正常组相比，TNF-α作用下VE-cadherin的表达明显降低（0．061±0．013vs0．093±0．014，P=0．049），而UTI可改善TNF-α导致的VE-cadherin表达降低（0．032±0．004vs．0．061±0．013，P=0．016）。结论UTI可抑制TNF-α引起的EA．hy926细胞通透性增加，且在一定范围内呈现出剂量依赖性。