碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术

目的:用本室制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测微量bFGF的技术。方法:将抗重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的杂交瘤细胞株,经再克隆化,选择高亲和力的抗bFGF杂交瘤细胞2H2。用ProteinA亲和层析法对2H2腹水型单抗进行纯化。结果:用2H2mAb建立了高灵敏度的间接、竞争ELISA检测bFGF方法,灵敏度分别达到10和1.0pg/孔,并用间接ELISA检测神经胶质瘤细胞SWO38上清中的bFGF含量。结论:为实验研究和临床应用提供了微量bFGF的检测方法。

大片形吸虫病早期诊断夹心ELISA方法的建立及应用

为建立一种早期诊断大片形吸虫病的试验方法,本试验对5株分泌抗大片形吸虫分泌排泄抗原(ES)单克隆抗体的杂交瘤细胞进行复苏、制备单克隆抗体,配对筛选出7D1、7D2单克隆抗体,将7D2作为包被抗体,7D1作为酶标抗体,通过条件优化,建立早期诊断大片形吸虫病的夹心ELISA方法。结果显示,当包被抗体稀释度为1∶6 400(0.208μg/mL)、采用5%脱脂奶粉封闭、酶标记抗体稀释度为1∶10 000(0.200μg/mL)时,最早可检测到感染此病第7天小鼠的血清循环抗原,其敏感性可达到1∶3 200(0.156μg/mL),与其他几种寄生虫抗原均无交叉反应,具有较高的特异性和稳定性。本试验成功建立了早期检测大片形吸虫病的夹心ELISA方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断大片形吸虫病的试剂盒奠定了基础,具有临床应用价值。

双单抗夹心ELISA方法检测EPF活性

目的建立双单抗夹心酶联免疫吸附试验法用于测定早孕因子(EPF)。方法筛选可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,制备腹水型单抗(McAb)并分离纯化,用改良碘化钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗,分析McAb的结合位点,通过抗体配对试验选择合适的捕获和检测McAb,建立双McAb-ELISA检测方法。结果筛选出二株稳定分泌抗EPF抗体的单克隆细胞株;两株单抗识别不同的抗原表位;双McAb夹心ELISA法测EPF活性灵敏度可达0.01ug/ml,线性测定范围在0.01～10ug/ml,2份同批血清标本分别重复8次测定,平均批内变异系数为7.7%,2份不同批血清分别重复6次测定,平均批间变异系数为5.8%。建立的双McAb-ELISA法灵敏度90.2%和特异度为92.8%。结论建立的双McAb夹心ELISA法,有优异的灵敏度和特异度,稳定性强,而且简便、快速,适用于血清EPF检测,并有一定的临床应用前景。

McAb－ELISA检测早孕因子抗原的研究

应用早孕因子单克隆抗体（ＥＤＦ－ＭｃＡｂ），建立早孕因子新的免疫学检测方法，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）。本文初步确立了用ＥＬＩＳＡ检测ＥＰＦ抗原的实验条件，并与Ｅａ一活性玫瑰花结抑制试验（Ｅａ－ＲＩＴ）进行了比较。结果表明，因ＥＬＩＳＡ检测ＥＰＦ抗原具有特异性好、敏感性高，判断结果客观的特点。

单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制

目的制备抗人神经生长因子（h NGF）单克隆抗体,并开发一种检测h NGF含量的ELISA试剂盒。方法以重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗h NGF的单克隆抗体,然后建立快速检测h NGF含量的ELISA检测试剂盒。结果获得1株可分泌抗h NGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。建立1种检测h NGF含量的ELISA试剂盒,该检测方法的回收率为85%-105%,灵敏度为0.63 ng/ml,变异系数〈10%,且特异性良好。结论成功制备了抗h NGF的单克隆抗体,并建立了一种可快速检测h NGF含量的ELISA试剂盒。

牛妊娠相关糖蛋白boPAG2双抗体夹心ELISA体系的建立

【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10^4)^(1∶11.96×10^4),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步鉴定。

ANTIGEN ASSOCIATION OF J6-1 CELL MEMBRANE ASSOCIATEDFACTOR RECEPTOR WITH MACROPHAGE COLONYSTIMULATING FACTOR RECEPTOR

Objective: To verify the antigen association of MAF-J6-1 receptor with M-CSFR and to further study the role of M-CSF and its receptor mediated juxtacrine in promoting leukemic cell proliferation. Methods: Monoclonal antibody (McAb) of MAF-J6-1R RE2 and polyclonal antibody (PolyAb) of rhM-CSFR were prepared. The specificity of McAb RE2 to M-CSFR was confirmed by indirect ELISA, cross-neutralizing assay with J6-1 cell colony formation and neutralization test by ELISA. Results: the reactive activity of purified RE2 to M-CSFR was over 1: 16000. The inhibitory activity of M-CSFR and MAF-J6-1R could be blocked by RE2 and anti-M-CSFR antibody. The reactivity of RE2 to M-CSFR could be reduced by M-CSFR. Conclusion: The specificity of RE2 to M-CSFR was confirmed and the antigen association of MAF-J6-1R with M-CSFR was proved. It suggests that M-CSF and its receptor mediated auto-juxtacrine stimulation could be an operative mechanism in either leukemia or nonhematological malignancies.

重组早孕因子的原核表达及多克隆抗体制备

对牛源早孕因子进行生物信息学分析,构建了含有促溶标签的原核表达载体pET-28a-srEPF,经IPTG成功诱导表达,亲和层析纯化早孕因子,再以重组蛋白为免疫原,免疫动物制备多克隆抗体,Western blotting对表达蛋白及其多抗进行检测。结果表明,成功制备早孕因子重组蛋白,分子质量为26 ku,纯化后BCA法测定其浓度为1.1 mg/mL,早孕因子重组蛋白和去除抑制区的EPF蛋白均可与制备的多抗特异性结合,间接ELISA测定其效价为1∶256000。

H因子结合蛋白抗原含量双抗夹心ELISA检测方法的优化与应用

目的优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价。方法筛选4种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量。结果确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.0000μg/mL、检测抗体1∶2000稀释、显色时间15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.0002μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%。亚家族之间抗原检测无干扰。多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05)。结论优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定。

血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备

目的表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体。方法将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化。用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。结果表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol。免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L。以此单抗为包被抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的最佳检测范围为1.5625～25ng/ml。结论成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础。

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。

EPF单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文用纯化的早孕因子（ＥＰＦ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过鼠－鼠杂交瘤技术，成功地建立了２株（１Ｂ＿６、２Ｆ＿（１０））分泌ＥＰＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞系。经检测，它们所分泌的抗体亚类均为ＩｇＧ＿１，杂交瘤染色体数目１００～１０６条，ＥＬＩＳＡ检测诱生腹水抗体效价为１：１．２８×１０￣５，连续培养生物学性状稳定。抗ＥＰＦ抗原的单克隆抗体的建立，为深入研究ＥＰＦ的生物学性质、特征提供了有力的工具。

抗重组人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体的研制及其初步应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术获得１０株抗重组人肿瘤坏死因子－α（ｒＨｕＴＮＦ－α）ＭｃＡｂ。７株ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１，２株为ＩｇＧ２ａ，１株为ＩｇＧ２ａ。１０株ＭｃＡｂ与淋巴毒素（ＬＴ或ｒＨｕＴＮＦ－β）、ｒＨｕＩＬ－６和载体菌菌体蛋白均无交叉反应。其中７株ＭｃＡｂ具有中和活性，７株ＭｃＡｂ能识到天然的ＴＮＦ－α。Ｇ１１和Ｅ６ＭｃＡｂ应用ＡＢＣ法免疫组化染色肝病患者组织细胞片得到明确的阳性结果。用２株识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了一步夹心ＥＬＩＳＡ法，检测ＴＮＦ－α的敏感性可达到１００ｐｇ／ｍｌ左右。

抗早孕因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立分泌抗EPF(Earlypregnancyfactor,早孕因子)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单抗并鉴定。方法用本实验室已纯化的早孕和肿瘤源性EPF作为抗原刺激Balb/c小鼠,用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,经4次克隆化,获得可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,注入Balb/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-A亲和层析纯化,SDS电泳和Western-blot等方法分析纯化结果。结果融合后获得一株稳定分泌抗EPF抗体的细胞株(C3D11),克隆化后,获得稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株,将增殖后的细胞注射Balb/c小鼠腹腔获得腹水型单抗,以亲和层析法纯化。SDS-PAGE分析显示纯化后去掉了大部分杂蛋白,免疫印迹分析抗体纯度较高,与抗原匹配性良好。结论本研究制备的EPF单克隆抗体为特异性抗EPF抗体。

早孕因子多克隆抗体的制备及应用

通过含有家兔早孕因子的重组质粒EPF-pET-32a(+)转化表达宿主菌Escherichia coli Rosetta,IPTG诱导,融合表达硫氧还原蛋白-兔早孕因子Trx-EPF。亲和层析纯化Trx-EPF,并在柱上进行肠激酶酶切,得到EPF蛋白并进行复性。EPF免疫波尔山羊,制备羊抗兔家兔早孕因子抗血清,硫酸铵沉淀纯化多克隆抗体,用于家兔早孕检测。Western-blot结果表明,羊抗兔家兔早孕因子多克隆抗体对家兔早孕的检出率达到100%。

血浆组织因子途径抑制物抗原含量的测定

组织因子途径抑制物是新确定的一种抗凝蛋白,它通过抑制因子Ⅹa和因子Ⅶa/组织因子(TF)而发挥抗凝作用。研究表明,血浆TFPI的改变与某些恶性肿瘤、败血症、血栓性疾病及DIC等多种疾病相关联。因此,对它的检测将有助于这些疾病病因病机的研究及临床诊断。鉴于国内目前尚未建立TFPI抗原检测方法,亦未确定国人TFPI血浆水平。本文报道了利用抗TFPI单克隆抗体用双抗夹心ELISA法检测了30例正常人血浆TFPI含量。

绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G-sepharose柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS-PAGE和Western blot分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果显示,细胞融合后得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81.3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊EPF抗体。

奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体。本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测。结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1∶12 800。结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础。

人结缔组织生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)免疫BalB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备CTGF单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),获得2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系7C7和8A11。两株细胞染色体众数分别为95条和91条;单抗亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG1型;间接ELISA法测定7C7和8A11腹水效价分别为:1.3×105和8.1×104;相对亲和力:7C7>8A11。CTGF单克隆抗体的制备为相关实验研究和临床诊断提供了条件。

肉牛妊娠初期血、尿中孕酮、妊娠相关糖蛋白、早孕因子的变化

[目的]探讨肉牛妊娠初期血液和尿液中孕酮(P_4)、妊娠相关糖蛋白(PAG)、早孕因子(EPF)的变化,为肉牛早期妊娠诊断奠定基础。[方法]采集肉牛配种后第0、1、8、17、21、28、35天的血、尿液,通过ELISA检测血、尿中P_4、PAG、EPF 3种激素的浓度。[结果]在配后0～35 d,妊娠与非妊娠母牛血、尿中P_4和PAG浓度变化平缓,而EPF差异较明显,3种激素血液中浓度均高于尿液中。其中,妊娠牛血液中EPF浓度在配后第8天显著(P<0.05)高于非妊娠牛。[结论]血、尿中EPF浓度变化能反映肉牛的妊娠状态。