5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段。

抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11。Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应。利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33(321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位。本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础。

东方马脑脊髓炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本试验通过RT-PCR从东方马脑脊髓炎病毒（EEEV）中扩增得到128bp的特异性保守序列,将其克隆到pMD20-T载体中,并进行体外转录,制备标准品cRNA。以10倍系列稀释的cRNA为模板,进行TaqMan MGB荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立了EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR的检测方法。进一步对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明,建立的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR最低可检测10拷贝/μL的cRNA;且与阴性对照及马鼻肺炎病毒（EHV-1）、马动脉炎病毒（EAV）、马流感病毒（EIV,H3N8）、西尼罗病毒（WNV）、西方马脑脊髓炎病毒（WEEV）和日本马脑炎病毒（JEV）均不发生交叉反应。所制作的标准曲线在1.0×10^1~1.0×10^6拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系,相关系数为0.998,标准曲线方程式为y=40-3.35logx;与常规RT-PCR相比,该方法更加快速,特异性和敏感性更高,灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。试验结果表明,建立了一种快速、高效、特异、敏感的EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法。

东方马脑炎E2蛋白原核表达及免疫活性初步研究

为构建东方马脑炎病毒E2基因原核表达载体,完成E2蛋白表达及其免疫活性研究。利用PCR方法扩增E2编码全基因,大小为1 260 bp,将酶切后目的片段连接到原核表达载体pET-30a(+)上,构建成重组质粒pET30a(+)-EEEV-E2,采用酶切和测序分析方法鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,诱导E2蛋白表达,并用SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析和鉴定目的蛋白;最后,用纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠随机分成4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组、E2蛋白免疫组和E2蛋白+弗氏佐剂免疫组,每组小鼠免疫2次,两次免疫间隔时间为14天,免疫剂量均为100μL/只;小鼠初次免疫后第10天,用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-12与TNF-α的浓度,加强免疫后第14天,用EEEV的假病毒检测血清中E2蛋白抗体的中和作用。结果表明完成了E2基因的原核表达载体pET30a(+)-E2构建和成功表达了带有His标签的E2融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在,大小为53.0 kDa;免疫小鼠血清中产生了高水平的IL-6、IL-12与TNF-α和具有较强中和作用的E2蛋白抗体。研究结果为今后E2蛋白作为基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要参考。

东部马脑脊髓炎病毒的分子生物学进展

东部马脑脊髓炎病毒属虫媒病毒,能引起人和马发生急性脑炎。东马病毒为单股正链RNA病毒,可分为南美型和北美型,包括两个开放读码框架,分别编码结构蛋白(E1,E2,E2,C,6K)和非结构蛋白(nsp1,nsp2,nsp3,nsp4)。其中E1/E2包膜糖蛋白以异二聚体的形式构成病毒颗粒外刺突。非结构蛋白主要参与负链RNA的合成。近来,随着研究深入,病毒受体越来越受到广泛关注。本文介绍东部马脑脊髓炎病毒结构、进化、复制、组装等方面的分子生物学进展。

基于多种可视化软件的东方马脑炎情报分析

基于多种可视化软件对1995-2015年2月东方马脑炎相关SCI论文和专利发布的数据进行挖掘,分析其总体概况、专利技术生命周期、学科研究领域和所属国家/地区合作竞争关系、机构及突出个人的基本情况等,展现各软件的使用特点,指出图书馆要掌握数据挖掘和信息可视化技术,以便提供满足用户深层次、个性化需求的参考咨询服务。

东方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用

为建立检测东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)的方法,本研究利用PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),针对EEEV NS1基因,设计特异性引物,通过优化反应条件,对核酸扩增产物采用DHPLC进行检测分析,核酸扩增产物形成DHPLC特征峰图,建立了EEEV的PCR-DHPLC快速检测方法。结果显示该方法与其他6种常见马病病毒均无交叉反应,未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰,具有较强的特异性;对梯度稀释的标准阳性模板的检测限可达到10拷贝/μL;利用本研究建立的方法与荧光定量RT-PCR对30份临床样品进行检测,两者符合率达100%。本研究建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可以用于EEE的病原学诊断及流行病学调查。

东方马脑炎病毒VLPs表达与免疫原性研究

目的表达东方马脑炎病毒(EEEV)病毒样粒子(VLPs),研究其免疫原性。方法采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到供体质粒pFastBacTM1上,构建成重组质粒pFastBacTM1-C-E,然后重组质粒经过基因重组作用与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)形成重组病毒BmNPV-C-E,BmNPV-C-E被转染到BmN细胞后以表达VLPs。VLPs鉴定表达正确后,用纯化VLPs与弗氏佐剂乳化成免疫原免疫小鼠,免疫剂量为15μg/只,免疫途径为后肢肌肉注射,免疫2次且间隔时间为14 d。2免后第7天检测免疫小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α含量,2免后第14天采用ELISA方法检测免疫小鼠血清内抗体IgG效价。结果研究结果显示实验组小鼠的CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α质量浓度与对照组相比差异均显著(P<0.01),免疫原实验组和VLPs免疫组2免后的血清效价分别为1∶128与1∶64,而对照组小鼠血清中没有产生IgG抗体。结论结果表明BmNPV-C-E能在BmN细胞中成功表达EEEV VLPs,并且VLPs能够刺激小鼠产生明显免疫反应,具有较强免疫原性,这为EEEV新型疫苗研究提供了重要参考。

东方马脑炎病毒战剂伤害特点分析

东方马脑炎病毒可导致人、马等出现脑炎症状,对人致死率为10%-20%,是国际社会公认的致死性病毒战剂。人、马传播需要通过黑尾脉毛蚊和环跗库蚊等吸食媒介,也可以经含有病毒的气溶胶通过呼吸道感染人类。我国并未出现相关疫情,和平时期应加强国境卫生检疫,防止从国外传入。

东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性

目的表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和CD8+T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P﹤0.01);小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。

真核表达东方马脑炎病毒衣壳蛋白Capsid抑制IFNγ应答基因转录

目的克隆东方马脑炎病毒(EEEV)衣壳蛋白(Capsid)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并初步研究其对干扰素(IFN)应答基因表达的影响。方法构建包含EEEV capsid基因的真核表达载体pcDNA3-Flag-capsid,以威格拉斯脂质体转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测其表达情况;应用定量PCR比较IFN效应基因Gbp1,Gbp2和Isg15在pcDNA3-Flag-capsid和空载体转染细胞中mRNA表达差异。结果构建了EEEV Capsid真核表达质粒,并且该质粒能够在293细胞中有效表达,同时定量PCR结果表明,与空载体转染对照组相比,外源导入EEEV Capsid抑制IFN应答基因Gbp1,Gbp2和Isg15的转录。结论真核表达EEEVCapsid抑制细胞内IFN应答基因的表达,为研究EEEV致病机制奠定基础。

东部马脑炎病毒E2基因与GM-CSF共表达质粒的构建及其免疫原性初步研究

目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果。方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒。Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性。通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4+/CD8+淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性。结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确。转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录。Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50000位置有特异性条带。将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光。免疫小鼠的最高血清抗体效价为1∶160,但细胞免疫未观察到明显的提高。结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价。