外源性Egr—1基因对人食管癌细胞系Eca109的转染效应

目的：观察外源性Egr-1基因的导入对食管癌细胞系Eca109的生长抑制作用，探讨该基因在恶性肿瘤基因治疗中的潜在价值。方法：应用脂质体基因转染法将真核表达载体PCMV－Egr-1质粒导入Egr-1表达消失的Eca109细胞，经G418筛选培养，形成抗生克隆，用PCR扩增质粒载体中的neo基因，证明质粒PCMV－Egr-1成功地导入Eca109细胞，用Westernblot和免疫细胞化学方法证实外源性Egr-1基因在Eca109细胞中获得稳定表达。细胞生长曲线测定、软琼脂集落形成率及Scid小鼠成瘤试验，观察外生Egr-基因对该细胞的生长抑制作用。结果：外源性Egr-1基因以功地民地入Eca109细胞并获得稳定的表达，细胞生长曲线表明，转梁Egr-1基因的Eca109细胞在Scid小鼠内肿瘤生长速率平均为30．5mg/day,未转染组为65．8mg/day(P<0.05).

塞来西布对食管癌ECA-109细胞系放射增敏效应的研究

目的:了解环氧化物酶-2(COX-2)选择性抑制剂——塞来西布对食管癌ECA-109细胞系的放射增敏作用。方法:选择ECA-109细胞系作为试验对象,检测ECA-109细胞系的COX-2表达水平,设塞来西布0.25、50、100μmol/L4个实验组,分别予6MV-X线照射0、2、4、6Gy后,再分别行MTT比色试验、克隆形成实验、流式细胞仪计数,检测细胞的增殖能力、克隆形成能力及凋亡3项指标。结果:不同辐射剂量与不同浓度的塞来西布对ECA-109细胞的增殖、凋亡率作用有统计学差异(P<0.05),塞来西布与放射对ECA-109细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用随塞来西布的浓度和照射剂量的增加而增强;塞来西布联合放射对ECA-109细胞的存活率、D0值和Dq值作用均小于单纯放射组,Dq变小;塞来西布和4Gy(6MV-X)联合用于ECA-109细胞其凋亡率有统计学差异(P<0.05)。结论:塞来西布能抑制ECA-109细胞增殖,诱导其凋亡。塞来西布与放射联合应用对ECA-109细胞的增殖抑制、诱导凋亡有协同增强的作用。

建立cDNA微矩阵基因芯片技术并分析食管癌细胞系Eca109基因表达谱

为筛选食管癌相关基因,建立并应用cDNA微矩阵技术分析了食管癌细胞系ECa109基因表达谱。结果显示,在886条基因中,ECa109细胞系与正常食管上皮细胞间存在显著差异表达的基因有107条(12.08%),其中表达上调的51条(5.76%),表达下调的56条(6.32%)。定量RT-PCR验证其中2个基因的表达水平,结果一致。建立T7 RNA聚合酶扩增技术,并对比分析了无扩增样品的基因表达谱,两者表现了较好的吻合性,这为cD-NA微阵技术分析原发性食管癌微量肿瘤细胞的基因差异表达谱提供了方法学。食管癌细胞株ECa109基因表达谱的分析也使我们对食管癌病变机制有了一个初步的了解。

DTT与顺铂诱导对食管癌Eca109细胞磷酸化P38表达的影响

目的:探讨磷酸化P38在顺铂和DTT诱导的食管癌Eca109细胞凋亡中的作用。方法:分别用DTT与顺铂诱导处理食管癌Eca109细胞,未加药组作为对照。采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;用免疫组化方法检测磷酸化P38的表达情况。结果:与对照组相比,DTT处理组及顺铂处理组细胞凋亡率明显升高。免疫组化结果显示:2处理组磷酸化P38的水平均明显高于对照组(P<0.05);DTT处理组磷酸化P38大部分位于细胞核内,而顺铂组磷酸化P38则主要弥散于细胞浆内。结论:磷酸化P38在DTT和顺铂诱导的食管癌Eca109细胞凋亡时细胞内分布不同,激活的P38可能通过不同途径参与细胞凋亡。

p38在二硫苏糖醇与顺铂诱导食管癌Eca109细胞凋亡中的作用

将人食管癌Eca109细胞分为七组,其中三组分别加二硫苏糖醇(DTT,Ds)、顺铂(Cs)及二药联合(Ds+Cs)处理细胞,另三组则先用磷酸化p38特异性抑制剂SB203580孵育,再分别加Ds、Cs及Ds+Cs处理细胞,未加药组作为对照(C′)。采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率。结果与C′比较,各组均存在明显差异(P均<0·01);SB203580孵育细胞后,与相应组别比较,Ds、Cs、Ds+Cs凋亡率均明显下降(P均<0·01)。证实p38MAPK在Ds和Cs诱导食管癌Eca109细胞凋亡中被显著激活,p38MAPK的激活可能是多种上游凋亡信号传导必经的共同通路。

DTT诱导P38核转位与食管癌Eca109细胞凋亡的研究

目的探讨P38的核转位与DTT诱导的食管癌细胞凋亡的关系。方法采用DTT处理食管癌Eca109细胞,未加药组作为对照。流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;免疫组化方法检测P38的磷酸化水平及磷酸化P38的核转位情况。结果与对照组相比,DTT处理组细胞凋亡率明显升高。免疫组化结果显示:处理组P38的磷酸化水平明显高于对照组(P<0.01),且处理组p-P38大部分定位于核内。结论p-P38核转位参与了DTT诱导的食管癌Eca109细胞凋亡。

P38在顺铂诱导食管癌Eca109细胞凋亡中的作用

目的探讨应激活化的P38MAPK在顺铂诱导食管癌Eca109细胞凋亡中的作用。方法实验分三组:10μg/mL顺铂处理组、SB203580孵育细胞2h后,再加顺铂处理组及对照组。应用流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率;采用免疫组化技术检测P38MAPK的磷酸化水平。结果顺铂处理组、SB203580加顺铂处理组及对照组的细胞凋亡率分别为17·1%、7·8%和3·1%。二处理组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0·01);与顺铂处理组相比,SB203580加顺铂处理组凋亡率明显下降(P<0·01)。顺铂处理组P38MAPK磷酸化水平明显高于对照组(P<0·01)。结论P38MAPK参与了顺铂诱导食管癌Eca109细胞凋亡,并在其中起促进凋亡的作用。

夏枯草对Eca109细胞的影响

目的研究夏枯草对人食管癌Eca109细胞的促凋亡作用。方法通过绘制生长曲线测定夏枯草对Eca109细胞生长增殖的影响,流式细胞术研究夏枯草诱导Eca109细胞凋亡的情况。结果100 mg/mL浓度的夏枯草组细胞生长明显被抑制,Eca109细胞在100 mg/mL夏枯草作用24 h后,流式细胞仪测定见明显亚二倍体凋亡峰。结论100 mg/mL的夏枯草可明显抑制Eca109细胞的生长并诱导其凋亡。

8-Br-cAMP对Eca-109细胞凋亡的影响

目的:探讨8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞凋亡的影响及其相关基因表达的变化。方法:采用TUNEL法检测细胞凋亡,应用原位杂交、组织化学、免疫组织化学以及RNA和蛋白质斑点印迹技术相对定量,观察8-Br-cAMP对Eca-109细胞凋亡相关基因及凋亡效应分子表达的影响。结果:8-Br-cAMP作用48 h后可显著诱导Eca-109细胞凋亡,并见到野生型(wt)p53及iNOS基因表达上调,bcl-2、c-myc基因表达下调,iNOS活性增强,Fas-IR减弱。结论:8-Br-cAMP通过调控凋亡相关基因及凋亡效应分子的表达,使之相互作用、相互协同,诱导人食管癌Eca-109细胞的凋亡。其中,wtp53在该凋亡的诸多因素中起着关键作用。

沉默RNF2基因对ECA109细胞裸鼠移植瘤体内放射增敏效应的影响

目的探讨沉默食管癌ECA109细胞RNF2基因对裸鼠移植瘤放射敏感性的影响。方法将36只BALB/c/nu裸鼠随机分为对照组、对照+照射组、空载组、空载+照射组、沉默RNF2组、沉默RNF2+照射组,于裸鼠皮下接种ECA109细胞构建裸鼠移植瘤模型,给予X线照射3 Gy5次。自接种后第14天开始每2~3d测量1次瘤最大径(a)和最短径(b),记录成瘤时间并按公式计算瘤体积(ab^2/2),绘制生长曲线。自首次照射24 h后每组处死3只,qRT-PCR和免疫组织化学法分别检测各组瘤组织中RNF2 mRNA和蛋白表达;观察各组剩余瘤照射后生长情况和体积变化。采用TUNEL法检测各组瘤组织细胞凋亡情况,分别采用qRT-PCR和免疫组织化学法检测各组瘤组织中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达情况。结果对照组与空载组瘤生长速度最快,沉默RNF2后生长速度减慢,沉默RNF2+照射组瘤生长速度最慢(P<0.05)。照射后各组凋亡水平均明显高于照射前(P<0.05),照射前、照射后RNF2沉默组凋亡水平均高于对照组、空载组(P<0.05)。照射前RNF2沉默组细胞中RNF2 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组、空载组(P<0.05),照射后这种趋势更明显。与对照组、空载组相比,照射前、照射后RNF2沉默组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平均下降(P<0.05);Bax mRNA和蛋白的表达水平均上调(P<0.05)。结论体内研究显示沉默RNF2基因有效增加了食管癌ECA109细胞裸鼠移植瘤组织放射敏感性,这与诱导细胞凋亡密切相关。