Ecarin测定血浆中凝血酶原的活性

目的:建立一种准确、快速和灵敏度较高的检测血浆中凝血酶原活性的方法。方法:以巨齿蛇毒中的有效成分Ecarin作为凝血酶原的激活剂,分别采用Ecarin凝固时间法(ECT)和发色底物法测定血浆中的凝血酶原的活性。结果:Earin浓度在1～8 u/ml范围内,随着血浆的稀释,ECT逐渐延长,ECT(lg)和血浆稀释度(lg)之间的相关系数均在-0.943以上,P<0.01;Ecarin浓度(lg)和ECT(lg)的相关系数均在-0.957以上,P<0.01。血浆稀释度为1:50、1:100、1:200、1:400时,Ecarin发色底物法所测血浆稀释度(lg)与A值(lg)之间的相关系数γ=-0.974,P<0.01。结论:Ecarin凝固时间法和发色底物法均具有良好的灵敏度,能较好地反映血浆中凝血酶原活性的变化。

以Ecarin测定血浆中凝血酶原的活性

目的 :建立一种准确、快速和灵敏度较高的检测血浆中凝血酶原活性的方法。方法 :以巨齿蛇毒中的有效成分Ecarin作为凝血酶原的激活剂 ,分别采用Ecarin凝固时间法 (ECT)和发色底物法测定血浆中的凝血酶原的活性。结果 :Ecarin浓度在 1～ 8u ml范围内 ,随着血浆的稀释 ,ECT逐渐延长 ,ECT(lg)和血浆稀释度 (lg)之间的相关系数均在 - 0 .94 3以上 ,P <0 .0 1;Ecarin浓度 (lg)和ECT(lg)的相关系数均在 - 0 .95 7以上 ,P <0 .0 1。血浆稀释度为 1:5 0、1:10 0、1:2 0 0、1:4 0 0时 ,Ecarin发色底物法所测血浆稀释度 (lg)与A值 (lg)之间的相关系数γ =- 0 .974(P <0 .0 1)。结论 :Ecarin凝固时间法和发色底物法均具有良好的灵敏度 。

原发性肝癌患者血浆凝血酶原测定的研究

目的:研究原发性肝癌患者血浆凝血酶原的变化,并探讨其诊断价值。方法:原发性肝癌病人15例,并设健康成人对照组30例。用Ecarin-发色底物法检测其凝血酶原总量与吸附后凝血酶原量,用一期法测定PT。结果:患者PT、凝血酶原总量与吸附后凝血酶原量均高于对照组,后者在原发性肝癌的阳性率为93.33％(14/15),如以超过正常值一倍为诊断值,其阳性率为73.33％(11/15)。结论:原发性肝癌患者血浆中异常凝血酶原量明显增多,可作为诊断标志物之一。

慢性肾功能不全患者血浆凝血酶原的研究

目的:研究慢性肾功能不全病人血浆凝血酶原的变化。方法:慢性肾功能不全病人30例,并设正常成人对照。用Ecarin发色底物法检测其血浆凝血酶原总量与吸附后凝血酶原量,用一期法测定PT。结果:患者PT高于对照组,凝血酶原总量改变不明显,吸附后凝血酶原高于正常对照组。透析后数据下降。结论:慢性肾功能不全的出血倾向与正常凝血酶原丢失及异常凝血酶原增加有关,后者可能由Vit.K代谢失常诱致。

锯鳞蝰蛇毒显色多肽基质法测定血浆异常凝血酶原

本研究采用锯鳞蝰蛇毒显色多肽基质法（Ｅｃａｒｉｎ法）测定原发性肝癌（ＰＨＣ）、其它肿瘤、慢性肝病及正常对照共１１４例血浆异常凝血酶原（ＤＣＰ）．结果显示：Ｅｃａｒｉｎ法测定血浆ＤＣＰ的批内变异为３．８％、批间变异为４．９％、平均回吸收率为９０．４％，ＤＣＰ诊断ＰＨＣ的敏感性为７２．３％、特异性为９７％、准确性为８６．８％。

毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的通过毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备重组人凝血酶原2(prothrombin-2),并利用锯鳞蝰(Echis carinatus)凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据Gen Bank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体p PICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3.1(+),瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺(pNA),且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。