猪ECH1基因部分序列的遗传变异分析

为了进一步研究烯脂酰辅酶A水解酶1(enoyl CoA hydratase,ECH1)基因的生物学功能,研究采用克隆测序结合PCR-RFLP的方法分析了民猪ECH1基因的部分DNA序列,并对其中的1个点突变进行了3个猪种内的基因型频率和基因频率计算。结果表明:研究所检测的ECH1基因序列与网上已有序列相比存在8个单核苷酸多态性(SNPs)位点,其中有2个造成酶切位点的改变;民猪和大白猪在PCR-RFLP-BamHⅠ位点的A、B基因频率均接近0.5,而长白猪B为优势等位基因。

Ech1的表达下调对小鼠肝癌淋巴道转移的影响及其可能机制

目的:探讨Ech1表达下调对小鼠肝癌淋巴道转移率的影响,及其与肿瘤相关蛋白Anxa7的相互关系。方法:将Ech1基因表达下调的Hca-F细胞植入小鼠足垫,28天后观察小鼠成瘤及转移情况。在Ech1基因表达下调的Hca-F细胞和对照Hca-F细胞中,通过Western blot检测Anxa7表达变化,同时在Anxa7表达下调Hca-F细胞和对照Hca-F细胞中通过Western blot检测Ech1表达变化。结果:下调Ech1基因的表达,使肿瘤细胞体内淋巴结转移率明显降低。Ech1表达下调后,肿瘤转移相关蛋白Anxa7表达增加;Anxa7表达下调后,Ech1蛋白表达下降。结论:肿瘤细胞Ech1基因表达水平与小鼠肝癌淋巴道转移密切相关,Ech1和Anxa7在Hca-F肿瘤淋巴道转移中可能相互作用。

CircECH1通过充当miR-365-5p海绵抑制猪前体脂肪细胞增殖

环状RNA(circRNA)是一种共价封闭RNA,在脂肪发育过程中具有重要作用。本研究旨在探讨猪环状RNA ECH1(circECH1)对前体脂肪细胞增殖的调控机制。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析、Sanger测序和RNase R酶消化法成功鉴定circECH1的稳定环状结构,其在马身猪各个组织中均有表达,并且其在脂肪组织中的表达量随日龄增加呈上升趋势。功能研究证明,干扰circECH1后,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。为进一步探究其分子机制,使用miRDB、miRWalk和RNAhybrid预测circECH1的下游靶基因。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA结合蛋白免疫沉淀技术,验证circECH1能靶向结合miR-365-5p。在猪前体脂肪细胞中过表达miR-365-5p会增殖相关基因PCNA和CDK1的表达量极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01);干扰miR-365-5p后增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量极显著降低(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。挽救实验结果显示,共转染si-circECH1和miR-365-5p inhibitor与单独转染miR-365-5p inhibitor相比,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量显著升高(P<0.01),增殖细胞数量显著升高。本研究结果证明,circECH1存在于马身猪的脂肪组织中,并且通过海绵吸附miR-365-5p调控猪前体脂肪细胞增殖,为进一步了解调控猪前体脂肪细胞的分子机制提供理论依据。

家蚕微孢子虫与家蚕ECH1和GAPDH蛋白的相互作用

【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。

Ech1基因表达下调对小鼠肝癌细胞株Hca-F黏附能力的影响

目的在蛋白质水平检测Ech1在小鼠肝癌高低淋巴道转移Hca—F细胞／Hca—P细胞中的表达及其对Hca-F细胞黏附能力的影响。方法采用荧光差异双向凝胶电泳（2DDIGE）和质谱技术定量分析鉴定Ech1在Hca—F细胞和Hca-P细胞中的表达；构建pGPU6／GFP／Neo--shRNA—Ech1质粒，稳定转染至Hca-F细胞中，并通过实时荧光定量PCR和Westemblot验证Ech1表达下调效果，检测Ech1基因表达下调后对细胞外基质和淋巴结的黏附能力。各组细胞间的差异采用单因素方差分析。结果Ech1在Hca-F细胞的表达明显高于其在Hca-P细胞表达;Ech1表达下调细胞株构建成功，Ech1基因表达下调后，降低Hca-F细胞对细胞外基质纤维连接蛋白和I型胶原成分的黏附能力，降低其对体内淋巴结的黏附能力。Hca-F组与pGPU6／GFP/Neo-shRNA-Ech1组黏附吸光度值的差异有统计学意义，层黏连蛋白和I型胶原吸光度值分别为1．42±0．26和1．14±0．07与1．01±0．27和0．90±0．09，P值均〈0．05。结论抑制Ech1基因和蛋白的表达，可以降低小鼠肝癌细胞株Hca—F细胞的黏附能力。

车叶草苷对少弱精症大鼠抗氧化应激及抗细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨车叶草苷(ASP)对少弱精症大鼠抗氧化应激及抗细胞凋亡的作用机制。方法:通过灌胃奥硝唑建立少弱精症大鼠模型,将SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、车叶草苷组(60 mg/kg)和通路抑制剂(第3周腹腔注射2 mg/kg)+车叶草苷组,每组10只。检测大鼠精子参数;酶联免疫吸附试验法检测血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;实时萤光定量聚合酶链式反应法检测睾丸组织B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)和核因子E2相关因子2(Nrf2)基因水平;蛋白质免疫印迹法检测睾丸组织Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1)水平。结果:与对照组比较,模型组精子活力、精子浓度、GSH-Px、GSH、SOD、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1水平下降(P<0.05),MDA和Bax水平上升(P<0.05);与模型组比较,车叶草苷组精子活力、精子浓度、GSH-Px、GSH、SOD、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1水平上升(P<0.05),MDA和Bax水平下降(P<0.05)。结论:ASP能有效改善少弱精症大鼠精子活力、精子浓度,减少睾丸组织细胞的凋亡,改善氧化应激损伤,Keap1/Nrf2信号通路的激活可能是其作用机制。

金丝桃苷对甲基苯丙胺诱导的PC12细胞损伤的保护作用机制研究

目的探讨金丝桃苷对甲基苯丙胺诱导的神经细胞损伤的影响及可能机制。方法建立甲基苯丙胺诱导的神经细胞损伤模型,使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法检测细胞存活率,彗星电泳法检测脱氧核糖核酸(DNA)损伤,通过检测神经细胞氧化应激相关指标及KELCH样ECH关联蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)通路蛋白表达变化,进一步探讨金丝桃苷产生保护作用的可能机制。结果与对照组比较,甲基苯丙胺组细胞存活率和抗氧化能力显著降低,DNA损伤程度和细胞凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与甲基苯丙胺组比较,金丝桃苷干预组细胞抗氧化能力、胞核内Nrf2含量及其下游蛋白血红素加氧酶1和γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平显著增高,细胞凋亡和DNA损伤程度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论金丝桃苷能降低甲基苯丙胺诱导的神经细胞损伤,其保护作用机制可能与激活Keap1/Nrf2通路,促进Nrf2入核及其下游蛋白表达有关。

血清Nrf2、Keap1水平变化与糖尿病视网膜病变分期间关系

目的探讨血清单核细胞核因子E2相关因子(Nrf2)、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)水平变化与糖尿病视网膜病变(DR)分期间关系。方法选取2020年4月—2023年2月如皋市中医院DR患者147例作为观察组,并根据DR分期分为非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR);另选取同期糖尿病无视网膜病变患者49例作为对照Ⅰ组,健康体检者49例作为对照Ⅱ组。对比3组及观察组不同DR分期患者血清Nrf2、Keap1水平,Spearman秩相关系数分析血清Nrf2、Keap1水平与DR分期间关系;多因素logistic回归分析血清Nrf2、Keap1水平对DR分期的影响;限制性立方样条图分析血清Nrf2、Keap1水平与DR分期的剂量-效应关系。结果观察组血清Nrf2水平低于对照Ⅰ组、对照Ⅱ组,Keap1水平高于对照Ⅰ组、对照Ⅱ组,对照Ⅰ组血清Nrf2水平低于对照Ⅱ组,Keap1水平高于对照Ⅱ组(P<0.05);随DR分期增加,血清Nrf2水平呈降低趋势,血清Keap1水平呈升高趋势(P<0.05);血清Nrf2水平与DR分期呈负相关(r=-0.806,P<0.001),血清Keap1水平与DR分期呈正相关(r=0.854,P<0.001);经多因素logistic回归分析,高血压、糖尿病发病年龄、总胆固醇对DR分期无显著影响(P>0.05),血清Nrf2水平是DR分期的独立保护因素,高脂血症、糖尿病病程、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清Keap1水平是DR分期的独立危险因素(P<0.05);限制性立方样条图分析显示,血清Nrf2(χ^(2)=11.800,P<0.001)、Keap1(χ^(2)=8.401,P=0.015)水平与DR分期间存在非线性关系,控制其他病变为固定变量,血清Nrf2水平<1.70μg/L、血清Keap1水平>3.00μg/L时,PDR风险显著增加。结论血清Nrf2、Keap1水平变化与DR分期关系密切,血清Nrf2水平<1.70μg/L、血清Keap1水平>3.00μg/L时提示DR进展至PDR的风险显著增加。

苦参总黄酮对醋酸铅诱导小鼠睾丸间质细胞氧化应激的改善作用及对Keap1/Nrf2信号通路的影响

目的:观察苦参总黄酮(SF)对醋酸铅(LA)诱导的小鼠睾丸间质细胞TM3氧化应激的改善作用及其对KELCH状ECH相关蛋白1(Keap1)/细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响,探讨SF改善由LA诱导的TM3细胞氧化应激的相关作用机制。方法:利用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(0、10、20、50和80µmol·L^(-1))LA和不同浓度(0、12.5、25.0、50.0和80.0 mg·L^(-1))SF分别干预24 h后的TM3细胞存活率;将TM3细胞随机分为空白对照组、LA组、LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组。除空白对照组外,其他各组均采用50µmol·L^(-1)LA诱导TM3细胞24 h建立TM3细胞氧化应激模型,其中LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞再分别给予12.5、25.0和50.0 mg·L^(-1)SF。利用MTT法检测TM3细胞存活率;WST-1法和硫代巴比妥酸(TBA)法检测TM3细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平;Western blotting法检测Nrf2、Keap1和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)蛋白表达水平。结果:MTT法检测,与0µmol·L^(-1)LA组比较,10、20、50和80µmol·L^(-1)LA组TM3细胞存活率明显降低(P<0.01);与0 mg·L^(-1)SF组比较,12.5、25.0、50.0和80.0 mg·L^(-1)SF组TM3细胞存活率明显降低(P<0.05或P<0.01);与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞存活率明显升高(P<0.01);WST-1法和TBA法检测,与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);Western blotting法检测,与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞中Nrf2蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Keap1和Caspase-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:SF对LA诱导TM3细胞氧化应激具有一定改善作用,并可降低TM3细胞中Keap1蛋白表达水平,升高TM3细胞中Nrf2蛋白表达水平。

胺碘酮通过激活Keap1/Nrf2通路减轻大鼠心脏缺血再灌注损伤

目的探讨胺碘酮对心肌缺血大鼠的治疗作用及机制。方法SD大鼠被随机分为对照组、缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)组、胺碘酮+IR组,每组8只,采用左冠状动脉前降支夹闭构建心肌IR损伤模型。TTC染色检测梗死心肌面积、苏木素伊红(hematoxylin eosin,HE)染色检测心肌组织病理变化;测定大鼠心脏功能;测定大鼠血清心肌损伤标志物[肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehy⁃drogenase,LDH)、肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnI)]及氧化应激指标[丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)];蛋白免疫印迹(Western blot,WB)测定Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor ery⁃throid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、SOD、醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1,NQO1]的蛋白表达浓度;实时聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定HO-1、SOD、NQO1的mRNA表达水平。结果与对照组比较,IR组大鼠心肌出现明显梗死、心肌组织呈明显病理损伤,胺碘酮+IR组心肌梗死面积明显减少、心肌损伤明显改善;胺碘酮+IR组大鼠心功能、血清CK-MB、LDH、cTnI浓度明显低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05);胺碘酮+IR组大鼠心肌细胞活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、血清MDA浓度明显低于IR组,而血清GSH、SOD浓度明显高于IR组,差异均有统计学意义(P<0.05);与IR组相比较,胺碘酮+IR组大鼠Nrf2明显升高、Keap1明显下降;胺碘酮+IR组大鼠HO-1、SOD2、NQO1的mRNA、蛋白表达均明显高于IR组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胺碘酮对心肌IR损伤大鼠具有保护作用,其机制可能与激活Keap1/Nrf2通路抑制氧化应激反应相关。

肝癌中烯酯酰辅酶A水解酶1的表达及其亚细胞定位

目的探讨烯酯酰辅酶A水解酶1(enoyl coenzyme A hydratase 1,Ech1)表达变化在肝癌中的意义及Ech1的亚细胞定位与肿瘤恶性生物学行为的关系。方法应用免疫组化法检测20例正常肝组织和30例原发性肝癌组织中Ech1的表达;应用亚细胞分离法检测Ech1在Hca-F和FEch1下调细胞的四种不同亚细胞组分中的表达。结果 Ech1在原发性肝癌中的表达高于正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05);Ech1表达与患者年龄、AFP值及是否伴有肝硬化或伴有病毒性肝炎差异无统计学意义(P>0.05)。Ech1在Hca-F和FEch1下调细胞的四种亚细胞组分中表达均定位于细胞质和细胞膜,并且细胞质表达强于细胞膜,细胞核和细胞骨架部分中不表达。结论 Ech1在肝癌组织中的表达明显高于正常肝组织,提示其可能与肝癌的发生、发展有关;体外培养细胞中Ech1表达调控对其亚细胞定位的改变没有影响,Ech1对肿瘤恶性生物学行为的影响可能不是通过其亚细胞定位改变而实现的。

铁皮枫斗颗粒对慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变大鼠的逆转作用及其机制研究

目的:观察铁皮枫斗颗粒对慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变的逆转作用,并对其相关机制进行探讨。方法:采用综合法建立慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变大鼠模型,待模型基本成功后,随机进行分组,并给予治疗,治疗周期3个月。研究结束,腹腔注射麻醉,取胃部展开后福尔马林溶液固定,做病理检测,一部分冻存,进行烯酯酰辅酶A水合酶1(Ech1)、Bcl-2相关X(Bax)及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白水平检测。结果:与模型组相比,铁皮枫斗颗粒各治疗组在炎症等级、腺体数量、腺体厚度均有显著性差异(P<0.05);上皮内瘤变及肠化情况也有一定的逆转,但差异没有显著性(P>0.05)。在Ech1和Bax蛋白表达水平上,高剂量显著升高,其他两组也有上升的趋势,但是差异不显著,Bcl-2各剂量组表达水平也有所上升,但是差异无统计学意义。结论:铁皮枫斗颗粒对慢性萎缩性胃炎有较好的治疗作用,对慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变有逆转作用,可能通过上调Ech1的表达起作用,同时也调节了胃黏膜细胞的凋亡。

ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌中的表达及临床意义

目的探讨ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌中的表达特点与预后的关系。方法采用免疫组化方法检测17例胆管癌及其癌旁正常胆管组织中ECHS1和PKM2蛋白的表达情况,并分析两种蛋白表达与胆管癌临床病理特征及预后的关系。结果ECHS1和PKM2蛋白在胆管癌组织中的阳性率分别为58.8%和64.7%,高于癌旁组织中的阳性率17.9%和21.4%,差异有统计学意义(P<0.05);ECHS1和PKM2蛋白与胆管癌患者性别、年龄及肿瘤直径无相关性,而与胆管癌分化程度、TNM分期及生存时间有相关性。结论 ECHS1和PKM2蛋白表达水平与胆管癌发生、发展及转移关系密切。

烯脂酰辅酶A水解酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人烯脂酰辅酶A水解酶(enoyl CoA hydratase,ECHS1)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA、Western blot、免疫沉淀、免疫组化和间接免疫荧光等方法对mAb进行特异性鉴定,通过Uni-ZAP XR正常成人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果:获得1株可稳定分泌抗人ECHS1 mAb的杂交瘤细胞株BGB095。该mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),可用于ELISA检测、Western blot、免疫沉淀、免疫组化等实验。结论:成功制备了抗人ECHS1的mAb,为代谢疾病和肿瘤的研究提供了有力的工具。

鹿茸多肽对轻度认知功能障碍大鼠学习记忆能力的改善作用及其调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的机制

目的:观察鹿茸多肽(VAP)对轻度认知功能障碍(MCI)模型大鼠学习和记忆能力及海马组织中KELCH状ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)信号通路相关蛋白表达的影响,并探讨其作用机制。方法:50只清洁级Wistar大鼠随机分为正常对照组、MCI组、吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组,每组10只,其中吡拉西坦组灌胃500 mg·kg^(-1)吡拉西坦,低剂量VAP组大鼠灌胃200 mg·kg^(-1)VAP,高剂量VAP组大鼠灌胃300 mg·kg^(-1)VAP,灌胃给药共18 d,第18天给药2 h后,采用腹腔中注射东莨菪碱诱导并复制MCI大鼠模型。Morris水迷宫实验观察各组大鼠行为学,HE染色观察活性大鼠海马组织病理形态表现,ELISA法检测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,Western blotting法检测各组大鼠海马组织中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果:Morris水迷宫实验,与正常对照组比较,MCI组大鼠逃避潜伏期和行为路径明显延长(P<0.01),穿过平台位置次数和有效区停留时间明显降低(P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠逃避潜伏期时间明显降低(P<0.01),吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠行为路径明显缩短(P<0.01),吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠穿过平台位置次数和有效区停留时间明显升高(P<0.05或P<0.01)。HE染色,与正常对照组比较,MCI组大鼠海马组织中细胞数量明显减少,且排列方式由有序变为相对混乱;与MCI组比较,吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠海马组织细胞排列较整齐,形态略规则。ELISA法检测,与正常对照组比较,MCI组大鼠血清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组和高剂量VAP组大鼠血清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法检测,与正常对照组比较,MCI组大鼠海马组织中Keap1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01);与MCI组比较,吡拉西坦组、低剂量VAP组和高剂量VAP组大鼠海马组织中Keap1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:VAP能够改善腹腔注射东莨菪碱诱导并复制的MCI模型大鼠的学习和记忆能力,其机制可能与提高模型大鼠海马组织中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平进而发挥抗氧化应激作用有关。

地骨皮提取物改善高血糖阿尔茨海默病小鼠认知功能的机制研究

目的探讨地骨皮对高血糖阿尔茨海默病(AD)小鼠认知功能的改善作用及可能机制。方法8只C57小鼠作为对照组,16只db/db小鼠通过脑室注射20μmol/L的β淀粉样蛋白_(25-35)10μl建立AD模型,并随机分为模型组和干预组(予地骨皮提取物5.0 g/kg灌胃处理,1次/d,连续4周),每组8只。注射后第30天检测小鼠血糖,苏木精-伊红染色和TUNEL染色进行病理学评估。水迷宫实验观察小鼠行为学改变,ELISA法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,Western blot检测脑组织氧化应激指标和相关信号通道蛋白表达。结果与对照组比较,模型组2 d开始逃避潜伏期延长,穿越原平台次数和目标象限时间降低(P<0.05)。与模型组比较,干预组2 d开始潜伏期缩短;穿越平台次数和目标象限时间延长(P<0.05)。苏木精-伊红染色和TUNEL染色显示,模型组脑组织可见细胞炎性损伤和凋亡,干预组较模型组减轻。与对照组比较,模型组血清及脑组织中SOD1、SOD2和MDA显著升高;磷酸化磷酸肌醇3激酶(PI3K)、核因子E2相关因子2(Nrf2)和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)蛋白表达上调(P<0.05);与模型组比较,干预组血清及脑组织中SOD1、SOD2和MDA显著降低;磷酸化PI3K(1.3±0.2 vs 1.8±0.5)、Nrf2(2.2±0.2 vs 2.6±0.3)和Keap1(2.2±0.3 vs 2.7±0.9)蛋白表达降低(P<0.05)。结论地骨皮能改善高血糖AD小鼠认知功能,其作用机制可能与PI3K、Nrf2、Keap1信号通路抗氧化应激反应调控有关。

新疆鼠尾草酚酸类成分对HK-2细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

目的研究新疆鼠尾草酚酸类成分对高糖高脂诱导的人肾小管上皮细胞HK-2氧化损伤的保护作用,并初步探讨其可能机制。方法将HK-2细胞分为对照组、模型组、卡格列净片组(阳性对照组,15μmol/L)、新疆鼠尾草酚酸纯化物组(10.8μg/mL)和4个单体成分组(丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸,均为50μmol/L)。除对照组外,其余各组均建立高糖高脂损伤细胞模型(500μmol/L棕榈酸+30 mmol/L葡萄糖处理48 h)并加药培养48 h。检测各组细胞的凋亡率以及细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量和谷胱甘肽(GSH)活性,并检测上述5组(丹参素组、原儿茶醛组、咖啡酸组除外)细胞中核转录因子E2相关因子2(Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、血红素氧合酶1(HO-1)、醌NADH脱氢酶1(NQO1)蛋白的表达。结果与对照组比较,模型组细胞的凋亡率显著升高(P<0.01);细胞中MDA含量显著升高(P<0.01),GSH含量和SOD活性显著降低(P<0.01);细胞中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达显著下调(P<0.01),Keap1蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,各给药组细胞的凋亡率及细胞中MDA含量均显著降低(P<0.01),各给药组细胞中GSH含量及酚酸纯化物组、原儿茶醛组、迷迭香酸组细胞中SOD活性均显著升高(P<0.01);酚酸纯化物组细胞中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达以及迷迭香酸组Nrf2蛋白表达均显著上调(P<0.01),酚酸纯化物组和迷迭香酸组细胞中Keap1蛋白表达均显著下调(P<0.01)。结论新疆鼠尾草酚酸类成分可减轻高糖高脂所致肾小管上皮细胞的氧化应激损伤,其作用可能与其激活Keap1/Nrf2通路、抑制氧化应激反应相关。

嗅三针对血管性痴呆大鼠海马CA1区损伤及Keap1/Nrf2/ARE信号通路关键蛋白的影响

目的:观察嗅三针对血管性痴呆(VD)大鼠行为学、海马组织病理形态、Keap1/Nrf2/ARE信号通路关键蛋白的影响。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、嗅三针组、抑制剂组,每组15只。采用双侧颈总动脉结扎术建立VD模型。嗅三针给予带电干预。采用Morris水迷宫检测大鼠行为学变化,HE染色检测海马CA1区组织形态变化,免疫荧光法检测海马CA1区Nrf2蛋白表达情况,Western blotting检测HO-1、NQO1蛋白表达情况。结果:模型组、抑制剂组大鼠寻找目标平台游泳的距离明显大于假手术组、嗅三针组。空间探索试验结果中,假手术组、嗅三针组穿越平台区次数、平台区游泳距离明显多于模型组、抑制剂组。模型组病理形态中细胞排列紊乱,坏死数量多于假手术组。嗅三针组海马区病理形态的细胞形态清晰、排列整齐,优于模型组。抑制剂组海马区细胞排列不齐,数目少于嗅三针组;嗅三针组Nrf2蛋白表达高于模型组、抑制剂组。嗅三针组大鼠海马组织HO-1、NQO1表达高于模型组、抑制剂组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:嗅三针能够改善VD大鼠认知障碍,减少海马损伤,通过激活Nrf2,调节HO-1、NQO1蛋白表达,发挥对抗氧化应激作用。

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 mRNA在神经胶质瘤中表达及临床意义

目的探讨Kelch样环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白(Keap)1 mRNA在神经胶质瘤中的表达及意义。方法采用荧光实时定量RT-PCR方法检测43例神经胶质瘤组织和31例正常脑组织中Keap1 mRNA表达,分析与临床特征的相关性。结果神经胶质瘤组织中Keap1 mRNA表达量为(0.59±0.64),显著低于对照组(1.09±0.93;t=2.57,P=0.01)。高级别神经胶质瘤(Ⅲ和Ⅳ级)中Keap1 mRNA表达量为(0.37±0.32),显著低于低级别组(t=2.20,P=0.04)。Keap1 mRNA表达水平与神经胶质瘤患者年龄和性别无明显相关性。结论 Keap1 mRNA的表达下调可能与神经胶质瘤发病有关。

葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用观察

目的观察葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用,并探讨可能作用机制。方法50只SD肥胖大鼠,腹腔注射1%链脲佐菌素(40 mg/kg),41只成功建成糖尿病大鼠模型,随机分为DM组8只、CM组9只、葡萄籽原花青素提取物低剂量组8只、中剂量组8只、高剂量组8只,另取10只肥胖大鼠为空白对照组(NC组),1 mL/kg腹腔注射柠檬酸缓冲液;低、中、高剂量组大鼠每日分别用50、250、500 mg/kg的葡萄籽原花青素提取物灌胃1次,连续3天,第3天灌胃24 h时尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg);NC组、DM组、CM组大鼠每日用10 mL/kg生理盐水灌胃1次,第3天灌胃24 h时,NC组、DM组尾静脉注射5 ml/kg生理盐水;CM组尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg)。末次给药48 h时各组大鼠断尾采血,检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),采血后处死各组大鼠,取肾组织检测肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),采用原位缺口末端标记法测算各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数,采用Western Blotting法检测各组大鼠肾组织核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)通路相关醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素单加氧酶-1(HO-1)、Nrf2、Keap1蛋白。结果与NC组比较,CM组及低剂量组血清SCr、BUN水平高(P均<0.05)。与CM组比较,NC组、DM组、低中高剂量组血清SCr、BUN水平低(P均<0.05);与低剂量组比较,中、高剂量组大鼠血清SCr、BUN水平低(P均<0.05)。与NC组比较,DM组、CM组、低中剂量组肾组织匀浆SOD水平低,DM组、CM组及低剂量组肾组织匀浆MDA水平高(P均<0.05)。与CM组比较,DM组、低中高剂量组肾组织匀浆组SOD水平高、MDA水平低(P均<0.05)。与CM组比较,中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数小(P均<0.05)。与NC组比较,CM组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低,中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与CM组比较,低中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与中剂量组比较,低剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论葡萄籽原花青素提取物可改善尾静脉注射造影剂糖尿病大鼠的肾损伤程度,且500 mg/kg时效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通过激活Nrf2—Keap1信号通路,预防造影剂诱导的糖尿病大鼠的急性肾损伤。