小鼠细粒棘球蚴感染早期对NK细胞影响的初步研究

目的:研究BALB/c小鼠细粒棘球蚴感染早期对NK细胞的影响。方法:用细粒棘球蚴感染BALB/c小鼠后,分别于1、3、5、7、9、12天处死小鼠,取其脾细胞,用流式细胞仪分析NK细胞的活性受体NKG2D的表达,LDH法检测脾细胞的杀伤活性。结果:①在细粒棘球蚴感染早期,小鼠NK细胞对Yac-1细胞的裂解率(NK细胞杀伤活性)与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);随着感染时间的延迟感染组小鼠NK细胞的杀伤活性呈下降的趋势,各组之间均有统计学意义。②随着时间的延长NK细胞的活性受体NKG2D的表达量呈下降的趋势,与对照组比较,感染后1、3、9、12天NKG2D的表达量差异都有统计学意义(P<0.05)。③随着时间的延长NK细胞数量呈下降的趋势,与感染前比较,感染后第1、3、9、12天NK数量差异都有统计学意义(P<0.05)。④细粒棘球蚴早期,感染小鼠NK细胞的杀伤活性与其活性受体NKG2D的表达呈正相关,相关系数r=0.679。结论:小鼠感染细粒棘球蚴后,可降低NK细胞数量、NK细胞活性受体NKG2D的表达和NK细胞的杀伤活性;小鼠NK细胞的杀伤活性与其活性受体NKG2D的表达呈正相关;包虫免疫逃逸可能是通过降低NK活性受体,降低NK细胞的杀伤活性来实现。

基于cox1基因对中国青藏高原地区细粒棘球绦虫遗传多态性的研究

通过对中国青藏高原地区细粒棘球绦虫的遗传多态性分析,了解该地区细粒棘球绦虫的遗传变异情况,为细粒棘球蚴病的防治提供基础材料。基于线粒体cox1基因全序列(1 609bp)分析中国青藏高原地区47个细粒棘球绦虫分离株的序列变异情况,并结合NCBI数据库中已公布的中国青藏高原和中东地区所有细粒棘球绦虫cox1基因全长序列,对比分析两个种群的遗传多态性特征。结果显示,47个样品均被确定为G1基因型,分为10个单倍型(C1~C10),其中优势单倍型C1与中东优势单倍型相同,且该单倍型呈世界性分布。中国青藏高原地区细粒棘球绦虫的单倍型多样性(Hd)与核苷酸多样性(π)较低,明显低于中东种群,两个地区Tajima’s D和Fu’s Fs检验值均为负值,遗传结构差异不显著。研究结果表明:中国青藏高原细粒棘球绦虫可能是由一个起源于中东的有效种群进入该地区后,经历了近期群体扩张或遗传瓶颈,在高原地区天然的地理隔离作用下,逐渐发展成了现在的种群。

细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定

通过ＥＳＴ方法对细粒棘球蚴ｃＤＮＡ文库进行筛选，将得到的ＥＳＴ序列送入ＧｅｎＢａｎｋ和ＥＢＩ进行同源性分析及登陆，对有意义的ＥＳＴ进行通测，得到了完整的细胞线粒体ｒＲＮＡ序列，并进行了同源性比较及质粒转化。为细粒棘球蚴的系统分类、鉴定及进化研究提供了新的有用依据。

灰仓鼠和草原兔尾鼠感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴的实验研究

用细粒棘球蚴 (Echinococcusgranulosus)原头节和多房棘球蚴 (Echinococcus multilocularis)原头节实验感染灰仓鼠(Cricetulusmigratorius)和草原兔尾鼠 (L agurus lagurus) ,并以 NIH小鼠和 BAL B/ c小鼠做对照 ,观察了继发性棘球蚴囊的发育情况。四种鼠的细粒棘球蚴感染率分别为 31% (37/ 118)、2 1% (6 / 2 8)、97% (30 / 31)和 89% (39/ 44 )。灰仓鼠和草原兔尾鼠继发囊发育远落后于 NIH小鼠和 BAL B/ c小鼠。灰仓鼠、草原兔尾鼠和 NIH小鼠对多房棘球蚴均可感染。灰仓鼠接种后第 2 5 d囊泡重量为 (0 .2 2± 0 .15 ) g,第 6 0 d为 (1.14± 0 .46 ) g,第 41d出现成熟原头节。草原兔尾鼠在接种后第 2 5 d囊泡重量为 0 .0 1g,第 6 0 d为 (0 .5 6± 0 .18) g,第 49d在组织切片和第 6 0 d在沉渣滴片中检出成熟原头节。作为对照的 NIH小鼠接种后直到第 90 d囊泡重量为 (0 .5 3± 0 .44 ) g,未查出成熟的原头节。实验证明灰仓鼠和草原兔尾鼠对多房棘球蚴十分敏感 ,在用于建立泡型包虫病的实验动物模型方面有独特优点。

新疆南、北疆绵羊源细粒棘球蚴原头节感染不同品系小鼠后发育情况的比较

为了解新疆不同地区绵羊源细粒棘球蚴对不同品系小鼠的致病力是否存在差别。用NIH小鼠、ICR小鼠、BALB／C小鼠和昆明株小鼠，在实验感染新疆南部和田和新疆北疆绵羊源细粒棘球蚴原头节后的不同时间剖检，比较观察细粒棘球蚴在其体内的发育状况。结果为四种小鼠的继发性细粒棘球蚴囊在雌性鼠中的发育较雄性间的为快。其中以北疆株在BALB／C小鼠中及和田株在NIH小鼠中的发育较好。在四种小鼠中北疆株比和田株的发育要好，生长亦较快。感染后6个月，北疆株鼠体内出现了发育成熟的原头节，而和田株的直至12个月剖检时，仍未见有成熟原头节的形成。表明；和田株和北疆株细粒棘球蚴原头节在四种实验小鼠中的发育情况存在着明显的差别。

新疆阿尔泰山和西部天山牛源细粒棘球蚴原头节感染不同品系小鼠后发育情况的比较

用新疆西部天山区域和阿尔泰山区域牛源细粒棘球蚴（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ Ｅ．ｇ）原头节实验感染不同品系小鼠后的不同时期剖检，比较观察细粒棘球蚴在其体内的发育情况。结果为四种小鼠的继发性细粒棘球蚴囊在雌性鼠中的发育较雄性间的为快．在四种小鼠中，西部天山牛源Ｅ．ｇ比阿尔泰山牛源Ｅ．ｇ的发育较好，生长亦较快．感染后 １０个月，西部天山牛源Ｅ．ｇ在鼠体内出现了发育成熟的原头节，而阿尔泰山牛源Ｅ．ｇ到第１２个月时仅有一只鼠出现发育成熟的原头节．表明西部天山牛源Ｅ．ｇ与阿尔泰山牛源Ｅ．ｇ在四种小鼠中的发育情况存在着明显的差别。

新疆家犬体内存在细粒棘球绦虫G1(羊)株和G6(骆驼)株的分子证据(英文)

目的收集家犬体内的细粒棘球绦虫成虫以建立新疆棘球蚴病的分子流行病学资料。方法对家犬体内成虫细胞色素c氧化酶Ⅰ基因序列进行测定以确定其亚株型。结果所有感染犬体内成虫的基因型为G1型。特别是1条家犬体内发现存在细粒棘球绦虫G1(羊)株和G6(骆驼)株混合感染的情况。结论在新疆阻断羊犬和羊骆驼循环圈是预防棘球蚴病的重要措施。作为终末宿主的家犬与人类的感染密切相关,对感染犬的管理应该加强。

基于cox2基因的细粒棘球绦虫环介导等温扩增检测方法的初步建立

目的建立一种安全、快速、高效的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的诊断方法——环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。方法根据细粒棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(cytochrome c oxidase subunit 2,cox2)基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测方法,采用LAMP法和常规PCR法检测细粒棘球绦虫、泡状带绦虫(Cysticercus tenuicollis)、扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)、羊曲子宫绦虫(Thysaniezia ovilla)、中点无卵黄腺绦虫(Avitellina centripunctata)、鞭毛线虫(flagella nematodes)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等9种寄生虫的DNA以验证LAMP法的特异性;分别用LAMP法和常规PCR法检测梯度稀释的含cox2基因片段的细粒棘球绦虫标准质粒后,比较两者的敏感性。采用LAMP、PCR和夹心ELISA法检测50份犬粪样,计算细粒棘球绦虫cox2基因的阳性率,评价所建立的LAMP法检测效果。结果LAMP法的特异性验证结果表明,仅在以细粒棘球绦虫DNA为模板的反应体系中出现特异性产物。LAMP法在细粒棘球绦虫标准质粒浓度为16.09 ag/μl时仍可见梯状条带,而常规PCR法仅可检测到浓度为16.9 fg/μl以上的质粒,LAMP法灵敏性是常规PCR法的1 000倍。对50份犬粪中细粒棘球绦虫DNA的检测结果显示,PCR、LAMP和夹心ELISA法检测结果相同,阳性率为8.0%(4/50)。结论基于细粒棘球绦虫线粒体cox2基因的LAMP检测方法操作方便、特异性较强、敏感性较高,适于细粒棘球绦虫感染犬的快速检测。

小鼠感染细粒棘球蚴早期TGF-β1表达分析

目的观察细粒棘球蚴早期感染BALB/c小鼠TGF-β1的表达情况。方法用细粒棘球蚴感染BALB／c 小鼠，分别于感染后第1、3、5、7、9、12d处死，取其脾细胞和外周血，采用酶联免疫法检测外周血细胞因子TGF-β1的含量，采用qRT-PCR法检测TGF-β1基因的表达量。结果实验鼠Eg感染后第1～12d，外周血TGF-β1的含量为2695．79～3055．09ng／ml，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；TGF-β1 mRNA相对表达量为0．029～0．060，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。TGF-β1及其mRNA表达量均有随着感染时间延长譬增高的趋势。结论TGF-β1在小鼠细粒棘球蚴感染早期表达增加，可能有利于细粒棘球蚴的免疫逃逸。

基于GenBank数据库的不同基因型细粒棘球绦虫系统进化分析

目的分析GenBank数据库中公布的细粒棘球绦虫各基因型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(Cox1)基因序列,探索细粒棘球绦虫各基因型在全球不同地区的遗传变异及分化情况。方法收集GenBank数据库中公布的不同基因型细粒棘球绦虫Cox1基因序列,排除同一地区内相同基因序列,寻找收集的基因序列间的变异位点并构建进化树,观察不同地区细粒棘球绦虫各基因型的地域聚集性及原始基因序列。结果通过对Cox1基因序列变异位点统计,发现细粒棘球绦虫Cox1基因突变类型以颠换为主,G1、G6、G7基因型在其分布的各地区均有相同Cox1基因序列,基因序列相对应的GenBank登录号分别为KY766891、MH300971、MH301007。系统进化分析发现G10基因型存在明显地域聚集性。结论细粒棘球绦虫G1、G6、G7基因型存在原始Cox1基因序列;G10基因型进化树中出现地域聚集性,存在生殖隔离趋势。

小鼠外周血淋巴细胞亚群在细粒棘球蚴包虫致敏反应中的作用

目的建立细粒棘球蚴过敏反应BALB/c小鼠模型,研究和探讨淋巴细胞亚群在细粒棘球蚴致敏反应中的作用。方法从自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏中提取原头蚴,培养40 d后,以50个微囊/鼠的剂量,通过腹腔注射接种BALB/c小鼠,对照组注射无菌生理盐水。感染6个月之后,每只小鼠按0.1 ml/10 g经腹腔注射羊源细粒棘球蚴粗制囊液致敏。对照组继续注射无菌生理盐水。激发过敏后1 h,根据评分将小鼠分为正常对照组、未致敏组、致敏组,每组各6只。取小鼠内眦静脉血,使用流式细胞仪检测B细胞、NK细胞、CD3^(+)/CD4^(+)/CD8^(+)T细胞,液相多重蛋白定量技术检测白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、IL-6、IL-13的变化。结果与对照组比较,未致敏组的B细胞百分比显著升高(P<0.001),致敏组的B细胞百分比上升,但差异无统计学意义。与未致敏组比较,致敏组的B细胞百分比显著下降(P<0.01)。与对照组比较,未致敏组和致敏组的NK细胞百分比显著下降(P<0.001和P<0.01)。与未致敏组比较,致敏组的NK细胞百分比显著上升(P<0.05)。与对照组比较,未致敏组的CD3^(+)T细胞和CD4^(+)T细胞百分比显著降低(P<0.05),CD8^(+)T细胞百分比显著升高(P<0.01);致敏组的CD3^(+)T细胞和CD4^(+)T细胞百分比显著升高(P<0.05和P<0.001),CD8^(+)T细胞百分比无显著变化。与未致敏组比较,致敏组的CD3^(+)T细胞和CD4^(+)T细胞百分比显著升高(P<0.05),CD8^(+)T细胞百分比显著降低(P<0.01)。与对照组比较,未致敏组IL-4、IL-6、IL-13含量都显著升高(P<0.001);致敏组IL-4含量升高,但差异无统计学意义(P>0.05),IL-6含量显著升高(P<0.01),IL-13含量下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。与未致敏组比较,致敏组IL-4、IL-6、IL-13含量都显著降低(P<0.001)。结论本研究成功建立了细粒棘球蚴过敏反应BALB/c小鼠模型,证明了Th2细胞引导的体液免疫应答在细粒棘球蚴囊液引起的过敏性休克中发挥着重要作用,为建立细粒棘球蚴囊液外溢所致过敏性休克患者的防治策略提供了重要的科学依据。

去氢骆驼蓬碱衍生物DH-330体外对细粒棘球呦线粒体凋亡通路中Cyt-C和Caspase-3的影响

目的探讨去氢骆驼蓬碱衍生物DH-330体外诱导对细粒棘球蚴线粒体调亡通路中Cyt-C和Caspase-3的影响。方法体外培养细粒棘球喲,随机分为空白对照组、溶剂对照组(终体积浓度为1%DMSO)、阳性对照组(阿苯达唑亚砜组,ABZSO,培养液中终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 pug/L)及DH-330处理组(培养液中终质量浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00ug/L).连续用药6d.染色观察各组细粒棘球蚴存活率,通过酶联免疫吸附试验检测评价DH-330对细粒棟球蚴线粒体Cyt-C释放量,Caspase-3酶活性的影响,绘制活力曲线。结果DH-330干预后对细粒棘球喲形态产生显著影响,50.100 yμg/L DH-330处理3 d和6 d细粒棘球蚴存活率分别为59.33%、43.25%和21.45%、3.25%,DH-330浓度组(培养液中终质量浓度为12.50、25.00、50.00、100.00 ug/L)对细粒棘球蚴的杀伤作用呈时间、浓度依赖性。作用6 d,ED50值为25.44 pug/L。给予不同剂量的DH 330干预后Caspase 3酶活性显著增高(P<0.01).且呈浓度依赖性与时间依赖性;作用3 d时随着药物浓度的增加,细粒棘球蚴Cy-C表达水平逐渐增高(P<0.05).6 d时随着药物浓度的增加,细粒棘球蚴Cy+-C表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论药物干预过程中,Caspase-3酶活性和Cyt-C释放量显著增加,表明线粒体凋亡通路可能参与DH-330诱导的细粒棘球蚴凋亡过程,具体机制有待进一步研究。