细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗的培育及鉴定

目的培育并鉴定细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗。方法利用转pBI—Eg95质粒的根癌农杆菌LBA440d株介导的苜蓿子叶浸染法，将Eg95基因导入紫花苜蓿基因组，转Eg95基因苜蓿外植体在含有卡那霉素的选择培养基上经愈伤、出芽和生根阶段生长出小苗，最后移栽到装有营养土的花盆中，生长2～3个月，获得完整的转Eg95基因苜蓿疫苗。提取转Eg95基因苜蓿的DNA、RNA及叶蛋白，采用PCR、RT—PCR、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）及Westernblot法进行鉴定。结果PCR、RT—PCR法在471bp处均扩增出目的条带；SDS—PAGE及Westernblot法可见转E驴5基因苜蓿蛋白在相对分子质量约16．5×10^3处出现特异条带，与预期结果相符：Bio—Rad Quantityone系统分析表达效率约占提取总苜蓿叶蛋白的0．06％。结论成功培育出细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗。

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾细胞亚群的变化

目的 探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群的变化.方法 热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒（pBI121）苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为4组,每组8只.口服灌胃组：灌胃接种100 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液 鼻腔黏膜接种组：滴鼻接种10 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液 空质粒对照组：滴鼻接种10μl转空质粒苜蓿叶蛋白提取液 正常蛋白对照组：灌胃接种100μl正常苜蓿叶蛋白提取液.小鼠每3天免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染（50个/只）,感染后第24周剖杀小鼠,分离脾细胞,用流式细胞仪检测脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群百分比.结果 口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.286±0.009）、CD8＋ T细胞亚群百分比（0.102±0.004）和CD4＋/CD8＋比值（2.814±0.014）均显著高于正常蛋白对照组（0.166±0.018、0.083±0.006、2.019±0.369,P〈0.01或〈0.05） 鼻腔黏膜接种组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.269±0.016）和CD4＋/CD8＋比值（2.955±0.986）与正常蛋白对照组比较明显升高（P均〈0.01） 口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比高于鼻腔黏膜接种组（P〈0.05） 空质粒对照组小鼠脾CD4＋、CD8＋T细胞百分比和CD4＋/CD8＋比值（0.169±0.018、0.093±0.019、1.852±0.188）与正常蛋白对照组比较,差异无统计学意义（P均〉0.05）.结论 CD4＋T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫转Eg95-Eg31融合基因苜蓿疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关.疫苗灌胃接种可能是一种较好的免疫途径.

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察

目的动态观察细粒棘球绦虫（喀）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫Balb／c小鼠后脾细胞因子的变化。方法88只Balb／c小鼠按体质量随机分为两组，用转基因苜蓿叶蛋白提取液（20g／L）100μl口服灌胃和10μl鼻腔黏膜接种分别免疫小鼠，每3天1次，连续2个月。在末次免疫后0（对照）、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20周各组剖杀4只小鼠，取脾，分离脾细胞，体外经瞻粗抗原（EgAg）或刀豆蛋白A（ConA）刺激培养48h，诱生白细胞介素（IL）-12、γ-干扰素（IFN-γ）和IL-10；经EgAg或脂多糖（LPS）刺激培养72h，诱生肿瘤坏死因子仅（TNF-α）。收集脾细胞培养上清液，常规ELISA法检测IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平。结果口服灌胃组的IL-12、IFN-γ、TNF—α．和IL-10水平分别在免疫后4～6、2～8、2～6、4～12周升高，分别在免疫后4、2、2、8周达最高水平，其值分别为（25．0±5．8）、（575．0±28．9）、（50．0±11．5）、（42．5±2．9）ng／L，与0周[（11．3±2．5）、（125．0±28．9）、（11．3±2．5）、（12．5±2．9）ng／L]比较，差异有统计学意义（P均〈0．01）；鼻腔黏膜接种组的IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4—6、2～10、4～10、6—16周升高，分别在免疫后6、4、6、6周达最高水平，其值分别为（25．0±5．8）、（725．0±28．9）、（27．5±2．9）、（60．0±11．5）ng／L，与0周[（11．3±2．5）、（125．0±28．9）、（11．3±2．5）、（12．5±2．9）ng／L]比较，差异有统计学意义（P均〈0．01）。EgAg、ConA、LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的脾细胞悬液组（P〈0．05或〈0．01），ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的EgAg刺激组（P〈0．05或〈0．01）。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗在免疫早期（2～10周）可诱导小鼠产生Th1和Th2混合型免疫应答。