细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法 采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论 成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。

人源细粒棘球蚴的RAPD分析体系建立

目的建立PCR-RAPD反应体系,提升细粒棘球蚴随机扩增多态性DNA(RAPD)遗传多态性研究的稳定性,为研究细粒棘球蚴的分类学以及包虫病的分子流行病学奠定基础。方法采用改进的酚-氯仿抽提法提取细粒棘球蚴基因组DNA,用单因素筛选方法建立PCR-RAPD分析体系。结果采用改进的酚/氯仿抽提方法提取细粒棘球蚴基因组DNA质量高,适用于PCR-RAPD扩增分析;在25μL体系中,RAPD-PCR扩增反应各成分的最佳浓度为:dNTP 0.2-0.3 mmol/L、Taq酶2.5U、随机引物0.8-1.4μmol/L,模板为60ng。PCR扩增最佳条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s、32℃退火45s、72℃延伸1min、共35个循环;最后72℃延伸10min;初步从20条引物中筛选出11条带型丰富的随机引物。结论酚-氯仿适用于提取细粒棘球蚴基因组DNA,优化的RAPD反应体系和筛选出的随机引物适合进行细粒棘球蚴RAPD遗传多态性分析。

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

目的:构建细粒棘球绦虫(E.g.)成虫全长cDNA质粒文库,并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA,应用SMART方法构建pBluescript II SK全长cDNA质粒文库,检测文库的重组率及容量;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5′端测序,归并unigene,计算unigene得率,全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%,库容量1.13×106;平均插入片段长度约为1.2 kb。24个随机阳性克隆测序,unigene比例为69.57%,全长性比率为64.71%。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,文库质量良好。

应用噬菌体随机肽库研究细粒棘球蚴抗原模拟表位

用抗细粒棘球蚴B抗原(EgB)多克隆抗体筛选噬菌体随机7肽库。经过5轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的4.15×10-5增加到第5轮的4.30×10-2,说明阳性克隆得到富集。随机挑取60个蓝色噬菌斑进行扩增,对其核苷酸序列进行测定分析并与EgB进行同源性比较。采用ELISA法对阳性噬菌体与抗EgB多克隆抗体结合特性进行检测,共检测出45个与抗EgB多克隆抗体结合的克隆株(阳性率为75%),其递呈的七肽序列与EgB的同源性低。采用ELISA法检测所选多肽对棘球蚴病所致过敏性休克患者抗血清的反应性,结果显示,细粒棘球蚴病患者抗血清与45个阳性噬菌体克隆反应的吸光度(A410值)比其与7肽库反应的A410值大2倍以上,该45个阳性噬菌体克隆与EgB多克隆抗体的结合是特异的。提示成功分析细粒棘球蚴囊液B抗原肽表位以及模拟表位。

细粒棘球蚴cDNA文库的构建和免疫筛选

目的构建细粒棘球蚴原头节的λZAPⅡcDNA文库，并对构建的文库进行免疫筛选。方法采集感染细粒棘球蚴的绵羊育囊中的原头节，用Trizol试剂抽提总RNA，用mRNA纯化试剂盒纯化mRNA作为模板合成eDNA，并对其进行末端平端化、EcoRI接头连接和磷酸化及XhoI酶切，然后应用SepharoseCL-2B分离柱对其进行分级分离，收集大于500bp的cDNA片段，使用GigapaekⅢGold试剂盒将合成的eDNA连接到λZAP-Ⅱ载体，并将重组载体包装到λZAP-Ⅱ噬菌体中，构建细粒棘球蚴eDNA文库。用囊型棘球蚴病患者混合血清对所构建的文库进行免疫筛选，并用NCBI中的Blast模块及其它生物信息软件对筛选出的阳性克隆进行生物信息学分析。结果成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡeDNA文库，文库的滴度为1．8×105噬菌斑形成单位（plaqueformingunit，pfu）／ml，插入片段长度范围在1．0～4．0kb间，平均插入片段长度为2．6kb，插入效率为93．8％。对所构建的文库进行免疫筛选，共筛选到5个阳性克隆，其中有2个为细粒棘球蚴新发现基因，新发现基因存在众多B细胞表位。结论成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAP-ⅡcDNA文库，初步免疫筛选得到2个新发现基因，生物信息学分析预测它们具有潜在的诊断价值。