基于微流控芯片技术的五种啮齿类动物疫病检测方法的建立

为提升啮齿类实验动物的检疫效率,本研究拟建立鼠痘病毒、流行性出血热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒和鼠肝炎病毒联检的微流控芯片方法并进行评价。针对5种病毒基因保守序列设计特异性LAMP引物,将引物包埋于芯片反应槽内,通过检测5种啮齿类动物病毒和另外3种病毒的样本来分析本方法的特异性,通过检测不同浓度的模板来评价本方法的灵敏度和重复性,通过检测35份小鼠的临床阳性样本和30份健康小鼠的肝组织样本来评价本方法的临床应用效果。结果表明,本研究建立的微流控芯片方法特异性好、灵敏度高、重复性佳,各指标间无相互干扰。本方法可提高啮齿类实验动物的检疫效率。

胎儿肢体畸形的产前超声诊断分析

目的探讨胎儿肢体畸形超声声像图特征及方法学特点。方法回顾性分析2010年5月至2012年5月在成都军区总医院接受系统性超声检查的6 336例孕妇,使用连续顺序追踪超声法(SCSA)检测胎儿上下肢长骨,观察手足时加用弧形扫查法,动态观察胎儿肢体的形态、结构、姿势及运动等情况。系统检查完成后对可疑或畸形部位进行三维成像作为补充,对胎儿肢体畸形的产前超声诊断结果进行分析。结果 6 336例孕妇经引产或出生后证实的胎儿肢体畸形20例,产前超声检出18例,分别为四肢短小畸形5例,致死性侏儒3例,海豹肢畸形1例,双侧桡骨缺失1例,一侧手缺失1例,双下肢小腿缺失1例,多指(趾)2例,足内翻3例,重叠指1例;2例漏诊分别为多指及重叠指。结论末端指趾数目及手足姿势异常易漏诊,是检查的难点和重点。

ELISA法检测野生和驯养长爪沙鼠携带病毒情况

目的检测野生长爪沙鼠和驯养长爪沙鼠的病毒携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学检测北京市地方标准提供依据。方法制备兔抗长爪沙鼠IgG抗体并用辣根酶标记。分别采集银川市、呼和浩特周边地区的野生长爪沙鼠以及长期驯养的长爪沙鼠血清,用间接ELISA进行流行性出血热、淋巴细胞脉络丛脑膜炎等人兽共患病毒及仙台病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒等啮齿类动物烈性传染病病毒抗体检测,并计算检出率。结果兔抗沙鼠的IgG抗体ELISA法效价1∶64 000以上,满足血清学检测要求。银川地区野生长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体阳性(6.0%),而呼和浩特和驯养的则未检出;但呼和浩特地区的野生长爪沙鼠有淋巴脉络丛脑膜炎病毒抗体检出(13.3%),而银川和驯养长爪沙鼠则没有。仙台病毒抗体的检出率为呼和浩特地区的最低(40.0%),宁夏和驯养动物相等(53.3%)。结论两地区野生长爪沙鼠和人工驯养长爪沙鼠病毒抗体的检出种类和检出率有所不同,在制定北京市地方标准时要综合考虑。

应用脾内直接免疫法制备鼠痘病毒单克隆抗体

采用脾内直接免疫法和杂交瘤技术获得５株杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养上清液和腹水中单克隆抗体效价分别为１∶８～６４和１０－３～１０－４（ＥＬＩＳＡ）。与其他１０种鼠源性病毒和ＢＨＫ２１细胞无非特异性反应。与传统免疫方法相比较，即节省了抗原、缩短了免疫时间，又可避免因免疫抗原致病性强而导致动物死亡的缺点，是一种具有实际应用的免疫方法。

鼠痘的病理诊断及鼠痘病毒抗原定位的研究

本文系统地观察了自然感染性鼠痘与实验性鼠痘的临床表现与病理形态学特征;讨论了鼠痘病理形态诊断的依据以及鼠痘与小鼠其它常见传染病的鉴别诊断要点;并采用免疫酶组织化学PAP技术,检测了鼠痘存档石蜡块中鼠痘病毒抗原在各脏器中的定位形态特点与分布规律。其目的在于将病理组织学诊断与特异性病原诊断,在形态学上结合起来,以达到早期、快速、准确的诊断目的。

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。

实验小鼠痘病毒感染检测分析

小鼠痘病毒急性感染可导致实验小鼠脱脚病 (鼠痘 )发作 ,临床症状明显 ,发病动物短期内大量死亡。近 10年某地区鼠痘发生次数依次为昆明小鼠 (7次 )、NIH小鼠 (3次 )、ICR小鼠 (2次 )和BABL c小鼠 (1次 )。无明显临床症状慢性持续性感染 (隐性感染 ) ,是病毒传播或转化成急性感染主要原因 ,用免疫荧光技术 (IFA)可检测到病毒抗体 ,鸡胚病毒培养意义不大。流行病学调查证实IFA抗体阳性小鼠群体脱脚病发病率显著高于IFA抗体阴性小鼠群体 (P <0 0 0 1)。

实验小鼠念珠状链杆菌和鼠痘病毒混合感染的诊断

经细菌分离，生化鉴定，血清学试验，尸体解剖及病理学检查，发现一起由念珠状链杆菌和鼠痘病毒混合感染而导致引起的实验小鼠发病死亡。

小鼠痘病毒的聚合酶链反应检测法

根据正痘病毒属血凝素基因保守区设计了一对引物，建立了鼠痘病毒的聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测法。结果表明，扩增产物长度为８４６ｂｐ，经限制性内切酶分析证实为鼠痘病毒。用本法可检出０．１ｐｇ鼠痘病毒基因。

鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。

可疑病鼠的鼠痘病毒分离和鉴定

用可疑病鼠的肝脏及病变组织经接种鸡胚绒毛尿囊膜及ＨｅＬａ细胞分离出一株病毒，该毒株可使鸡胚绒毛尿囊膜上产生典型痘斑，通过细胞病变形态、病变组织嗜酸性包涵体、电镜观察及特异血清学鉴定，证实所分离病毒符合鼠痘病毒的特征。

检测鼠痘组织原位杂交法的建立

目的 建立用组织原位杂交检测鼠痘的方法。方法 利用已知引物序列 ,以从感染鼠痘的陈旧组织中提取的病毒DNA做模板 ,在进行PCR扩增的同时用地高辛进行标记 ,将扩增的DNA片段作为探针用于组织原位杂交。结果 血清学检查确诊为鼠痘的标本中出现蓝紫色杂交阳性信号。阴性及特异性对照中未出现阳性信号。结论 组织原位杂交是一种适合基层病理检测单位的快速诊断方法。

围生儿出生缺陷123例监测结果分析

目的通过对2007—2012年123例出生缺陷儿的分析,为临床预防和治疗、有效降低出生缺陷发生率提供依据。方法对2007—2012年分娩的围产儿及出生缺陷儿,进行监测统计和分析。结果出生缺陷类型前4位是肢体畸形、唇腭裂、尿道下裂、胎儿水肿综合征,其发生率分别为30.9%、19.5%、13.0%、12.2%。乡村地区发生率明显较城镇高。结论加强婚前检查,普及优生优育知识,特别是边远山区乡村人群,进行孕早期保健是预防出生缺陷的关键,加强对高危妊娠的检测和产前筛查,达到及早干预,是降低围产儿出生缺陷率的重要手段。

应用qRT-PCR方法检测鼠痘病毒在小鼠不同组织中的差异分布

鼠痘(mouse pox)是由鼠痘病毒(Ectromelia virus,ECTV)感染实验小鼠引起的一种毁灭性、烈性传染病,为SPF小鼠必须排除的病原之一。本研究基于ECTV主要核蛋白P4b基因片段建立了实时定量PCR方法(real-time quantitative PCR,qRTPCR),用于检测C57BL/6小鼠感染ECTV后心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中的病毒载量,并用病理组织学观察验证了qRT-PCR方法的特异性和可靠性。结果表明,所建立的qRT-PCR方法能够准确检测小鼠感染后d5和d7不同组织的病毒载量,d5不同组织中病毒载量低于d7,与病理组织学检测结果一致。本研究建立的qRT-PCR检测方法且具有较高的灵敏性、特异性和可靠性,可用于ECTV感染细胞和组织器官中病毒载量、分布和消长动态的定性定量检测。

鼠痘感染的诊断及鉴定方法的研究

本文采用多种检测方法，对临床上怀疑是鼠痘病毒感染的小鼠进行诊断。结果表明：病理组织学检查与免疫组织化学技术的应用，将形态学观察与特异性抗原诊断结合起来。

“海豹肢”畸形胎儿产前超声表现

我国新生儿缺陷的发病率约为5.6%,其中先天性心脏病的发病率居首位,肢体、唇裂畸形次之,“海豹肢”畸形较少见。本研究报道4胎“海豹肢”胎儿的产前超声表现,旨在提高孕中早期超声诊断“海豹肢”畸形的能力。

鼠痘病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种鼠痘病毒(ECTV)的可视化快速检测方法。方法通过序列分析选择3段ECTV序列保守区域设计了9套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320C仪监测反应进程并筛选最佳引物组合,优化反应条件,建立了对ECTV核酸进行特异性扩增的LAMP检测方法,并可通过加入目测荧光检测试剂肉眼判断结果。对所建立的方法进行了敏感性、特异性评估,并对人工感染样品进行了检测。结果该方法在63℃恒温下作用60 min,ECTV DNA获得了高效特异性扩增,与其余常见小鼠病毒无交叉反应;最低检出量为530 fg/μL,是常规PCR的10~3倍,加入目测荧光染料判断结果与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。结论建立的ECTV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏和操作简单的特点,或具有良好应用前景。

鼠痘病毒感染机制及其检测方法研究进展

概述了鼠痘病毒(ECTV)入侵动物机体后感染传播的机制,包括小鼠的天然抗病机理、机体免疫应答以及病毒感染的致病机理等。同时总结了检测ECTV的试验动物法、病理学方法、血清学方法和核酸诊断方法等的优缺点。通过系统了解ECTV的感染途径和诊断方法 ,有助于防控ECTV的发生及传播。

胎儿肢体缺失的产前超声诊断

目的探讨胎儿肢体缺失的超声表现与产前超声诊断价值.方法采用连续顺序追踪超声法(SGSA)对29例产前超声检查的孕妇行胎儿肢体检测,并对引产后胎儿标本行模拟宫内超声检查.结果29例胎儿共有12种66个肢体缺失,产前超声共检出15例51个肢体缺失,其中23例肢体缺失合并其他畸形,仅有6例为单独肢体缺失;14例胎儿的15个肢体缺失漏诊.结论SCSA是产前超声诊断胎儿较大肢体缺失的可靠方法.

骨盆均衡术治疗短肢畸形继发固定性骨盆倾斜的研究和随访观察

目的 探讨手术治疗短肢畸形继发固定性骨盆倾斜的方法。方法 设计骨盆均衡术，即将短肢侧髂骨延长，对侧髂骨缩短，并通过双侧髂骨截骨线以下的骨盆环旋转移位，达到一次性纠正短肢畸形继发固定性骨盆倾斜、均衡两下肢不等长和改善短肢侧髋臼发育不良等复合畸形。结果 选择随访 2年以上的 32例患者，男 19例，女 13例；年龄 14～ 34岁，平均 22岁。其中 24例为脊髓灰质炎后遗症即一侧短肢畸形继发固定性骨盆倾斜，同时伴有短肢侧髋臼发育不良等畸形； 7例为幼儿时一侧髋关节结核融合后短肢畸形继发固定性骨盆倾斜； 1例为骨盆创伤后继发固定性骨盆倾斜。随访时间为 2年 6个月～ 13年 6个月，平均 6年 8个月。随访结果， 32例骨盆倾斜患者均获满意纠正，双下肢明显均衡，髋关节稳定性显著改善。在术前需扶拐助行的 29例患者中，术后 25例可弃拐步行， 3例可扶单拐步行， 1例拄棍步行； 3例术前跛行者，术后走路姿势明显改善。作者同时对骨盆均衡术有关的解剖学及应力电测试验等进行了讨论。结论 骨盆均衡术是治疗短肢畸形继发固定性骨盆倾斜有效的手术方法。