用顺序注射系统控制微流控芯片中的Edman降解

用顺序注射系统控制微流控芯片中的Edman降解反应,提高了Edman降解的自动化程度,得到蛋白质或多肽N-端氨基酸残基结构的准确信息.对固体吸附材料的选择、顺序注射程序的设计和优化及影响Edman降解反应的因素进行了讨论.该控制技术在蛋白质组学的研究中有一定的应用前景.

Edman降解中异硫氰酸苯酯新修饰位点的发现和验证

Edman降解是最早建立的一种用于多肽和蛋白质氨基端测序的方法,该方法现在仍被广泛用于生物化学领域。随着高通量蛋白质组学技术的发展和应用,该方法中的异硫氰酸苯酯反应被用于修饰蛋白质氨基端,并用于检测蛋白质水解位点。但还没有异硫氰酸苯酯是否可以修饰其他氨基酸侧链并影响多肽序列分析的研究。为了探究其修饰其他氨基酸的可能性,本文利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)研究了异硫氰酸苯酯对一个模型肽的化学修饰。质谱数据解析后发现在高浓度异硫氰酸苯酯的反应条件下,组氨酸上可以引入一个新的异硫氰酸苯酯修饰位点。这一修饰位点的发现预示着通过改变实验条件或分析方法,可以更准确地利用Edman降解和蛋白质组学技术分析多肽和蛋白质。

马氏钳蝎蝎毒短肽BmK622的分离纯化和一级结构测定

应用凝胶过滤、离子交换和HPLC反相色谱法从马氏钳蝎粗毒中分离纯化得到蝎毒多肽BmK62 2 .联合运用串联质谱法和Edman降解法 ,鉴定了BmK62 2N端 19个残基的序列 ,经过数据库检索 ,发现数据库中用cDNA克隆方法鉴定了序列的马氏钳蝎蝎毒短肽BmTX3一级序列N端 19个残基与BmK62 2已测定的N端 19个残基序列完全相同 ,BmK62 2的分子量测定和氨基酸组成分析的结果表明 ,BmK62 2与BmTX3分子量相同、氨基酸组成一致 ,从而BmK62 2的一级结构为 :FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQGKCQNNQCRCY .

串联质谱在多肽测序中的应用

采用纳升喷雾(Nano)技术和碰撞诱导解离(CIDcollisioninducddissociation)方法,在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOFelectrspectrometryionization-quadrupole-timeofflight)上,对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序(denovosequence),结果证明质谱的denovosequence可以方便有效的解决传统的Edman降解法测序中常见的实际问题,如末位残基的丢失,赖氨酸和亮氨酸难鉴定等,此方法的建立是对Edman降解测序法很好的补充.

世纪之交的蛋白质序列测定技术

对蛋白质序列测定技术的发展过程作了简要回顾，介绍了近年在该方法学领域的主要进展，其中包括Ｎ－端顺序测定的微量化、毛细管ＨＰＬＣ与毛细管电泳的应用、新的Ｃ－端化学降解测序方法，以及快原子轰击（ＦＡＢ）、电喷雾（ＥＳＩ）和基质辅助激光解吸电离－飞行时间（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）质谱在蛋白质序列测定中的应用，还对世纪之交该领域的发展趋势作了扼要的展望。

串联质谱法在合成多肽药物结构确证中的应用进展

目的:综述串联质谱法在合成多肽药物结构表征方面的应用进展,为该类药物的结构表征提供方法参考。方法:以“合成多肽药物”“多肽测序”“串联质谱”“质谱法”“结构确证”“Synthetic polypeptide drugs”“Peptide sequencing”“Tandem mass spectrometry”“Mass spectrometry”“Structure interpretation study”等为关键词:,组合查询了2000 年1 月-2019 年1 月中国知网、万方、维普、Springer Link、Web of Science、PubMed等数据库中的相关文献,对串联质谱法应用于确证合成多肽类药物结构的研究进展进行归纳与总结。结果与结论:共检索到相关文献192 篇,其中有效文献52 篇。合成多肽药物主要由氨基酸构成,这类药物在结构确证研究方面与一般药物有所不同。根据目前相关技术指导原则以及有关文献研究,合成多肽药物结构表征的主要内容包括分子量测定、氨基酸组成和序列分析、二硫键分析以及二级结构分析等。近年来,串联质谱法及其与其他方法的结合在合成多肽药物结构确证中应用广泛,成为Edman降解多肽测序法的有效补充,且其因灵敏度高、分析速度快、所需样品量少等优点,已成为确证多肽药物结构的有力工具。

福建产圆斑蝰蛇(Vipera russelli siamensis)蛇毒毒性磷酯酶A2的氨基酸组成和N-末端部分氨基酸顺序的测定

福建产圆斑蝰蛇毒毒性磷酯酶A分子由18种氨基酸的124个残基组成,由此计算它们的分子量为13,883。分子中天门冬氨酸、甘氨酸、酪氨酸和半胱氨酸残基的含量较高,但只含有一个甲硫氨酸和一个色氨酸残基。用手工Edman降解方法测出毒性磷酯酶A的氨基端部分氨基酸顺序为:A(1)n-Leu-Phe-Gln-P(5)e-Ala-Arg-Met-ILe-A(10)n-Lys-Lys-Leu-Gly-A(15)-Phe20-(-)-Phe-(-)-A(20)n-Tyr-Ile。

重组人胰岛素原料药N末端氨基酸序列的测定

目的:建立重组人胰岛素原料药N末端氨基酸序列的测定方法。方法:基于Edman降解原理,重组人胰岛素原料药样品经1%乙酸溶液处理,采用PPSQ-53A蛋白质测序仪依序切割N末端氨基酸后,注入高效液相色谱仪,使用Wakopak Wakosil PTH-GR硅胶柱,通过梯度洗脱分离,流速为0.3 ml/min,柱温为35℃,进样体积为50μl,PDA检测器分析波长为269 nm。同时,采用PPSQ-53A蛋白测序仪进行等度洗脱分析N末端序列。结果:重组人胰岛素原料药N末端氨基酸理论序列:A链为Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln;B链为Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。经测定,样品梯度洗脱的测定结果与理论序列一致,等度洗脱获得的N末端序列也与理论序列一致。结论:所用方法操作简便、可行,能够用于测定重组人胰岛素原料药的N末端氨基酸序列。

N端测序作为单克隆抗体常规放行分析方法的探讨

旨在探讨N端测序作为单克隆抗体常规放行分析方法的适用性。应用Edman降解法、质量肽图法对两个针对不同靶点的单抗进行N端测序,用肽图法寻找二者的特征性鉴别肽段,用离子色谱、毛细管区带电泳和成像毛细管等点聚焦电泳进行异质性分析。Edman降解法显示两个单抗轻链和重链的15个氨基酸分别完全一致,质量肽图法显示二者轻重链的T1肽段分别完全一致,而肽图法和3种异质性分析方法则可对两个抗体进行有效鉴别。由于人源化或人源单抗序列框架数量较为有限,两个单抗的N末端序列完全相同,运用Edman降解法进行N端测序是否能作为单抗的常规放行分析方法值得进一步商榷,同时上述多种方法可运用于单抗的鉴别分析,并可对其异质性进行控制,较N端测序分析更具有客观性。

N端焦谷氨酸环化封闭类单克隆抗体药物的N端测序方法

目的:对于直接用N端测序仪无法进行测序的N端焦谷氨酸环化封闭的抗体类药物,去除焦谷氨酸后实现对其N端序列的从头测序。方法:对抗体的重轻链分别进行N端测序无果,再通过LC-MSMS对其重轻链N端的焦谷氨酸进行确认,证明其为焦谷氨酸封闭。对抗体蛋白进行焦谷氨酸氨肽酶酶解后,再通过N端测序仪进行Edman降解法N端测序,获得抗体药物重轻链的N端氨基酸序列。结论:抗体药物的重轻链N端经过N端测序仪测序和LC-MSMS分析,确定均为焦谷氨酸封闭。再经过焦谷氨酸氨肽酶处理后进行N端测序仪从头测序证实抗体药物的N端序列与理论序列一致。

一种源自北非蝎的抗昆虫毒素Am IT的结构与功能鉴定(英文)

本研究主要分离和鉴定了一种源自北非蝎被称为Am IT的新毒素。详细分析了Am IT对昆虫神经索钠电流的调节效应。Am IT经凝胶过滤纯化后通过C18反相高效液相色谱法纯化。采用雄性德国蟑螂(德国小蠊)的幼虫和C57/BL6小鼠进行Am IT体内毒性分析。Am IT与两种β毒素的竞争实验则采用125I修饰的毒素通过与大鼠脑突触体膜的放射免疫法测定。Am IT的氨基酸序列通过Edman降解法测定。在结合实验中,Am IT被观察到与另一种源自北非蝎的毒素AaH IT4存在竞争效应。而且它可以被β型毒素的抗体识别,由此说明它与β型毒素(或相关毒素家族)的结构相似。新毒素显示了双重的活性,它既能与抗哺乳动物毒素在结合实验中竞争,又能促使昆虫躯体产生收缩反应。该毒素能够竞争携带放射标记的β毒素Css IV与大鼠突触体膜钠通道的结合。通过氨基酸序列分析,Am IT显示出与AaH IT4有92%的同源性。以上结果说明,Am IT不但显示了隶属于旧大陆的抗昆虫毒素的性质,表现为结合于昆虫的钠通道;而且它与隶属于新大陆的抗哺乳动物毒素类似,表现为对小鼠的毒性。因此,Am IT与AaH IT4在结构与功能上是极为类似的。