迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

迟缓爱德华菌外膜蛋白抗原性分析

目的 :分析迟缓爱德华菌 (Et)外膜蛋白 (OMP)的抗原性。方法 :用Western blotting分析 2 7株Et与EtATCC15 94 7OMP抗血清的转印情况 ,用ELISA、杀菌力试验和凝集反应检测OMP诱导的抗体滴度。结果 :2 1株致病株中有 2 0株能与EtATCC15 94 7株OMP抗血清转印出清晰的条带 ,分别为 33k、35k、38k、4 5k ,而非致病株和另一株致病株Et12 2的OMP则没有反应带 ;ELISA、杀菌力试验和凝集反应表明 ,ATCC15 94 7和JEL4株的OMP均能诱导高滴度的杀菌抗体和抗OMP抗体 ;不同程度稀释的抗ATCC15 94 7OMP血清及抗 35k、4 5k血清还能对小鼠提供一定的保护力。结论 :EtOMP33k、35k、38k、4 5k可能为保护性抗原 ,OMP可作为疫苗的候选成分。

迟缓爱德华菌全菌及外膜蛋白的免疫力比较

目的 比较观察Et ATCC15947株的全菌（WCB）及外膜蛋白（OMP）对小鼠和鲫鱼免疫效果。方法 用全菌凝集试验及ELISA测定抗体滴度,以迟发性变态反应（DTH）观察细胞免疫情况。结果 免疫小鼠抗体滴度14 d时,以全菌组最高,而在28 d时以OMP+LPS组最高。保护率分别是:OMP+沙门氏菌LPS>全菌组>OMP>OMP+FCA。免疫鲫鱼第1周OMP+LPS注射组即能测到抗体,而全菌组则需2～3周,但强化免疫后均能升高至相似的滴度,浸泡组则只在刚免疫的2～3周可测到低滴度的凝集抗体。保护率:OMP+LPS注射组>全菌注射组>全菌浸泡组。结论 给小鼠和鲫鱼注射全菌和OMP均能提供良好的免疫保护,在有佐剂LPS存在下,OMP效果更好。

鮰爱德华菌黄颡鱼分离株外膜蛋白的抗原性分析

以黄颡鱼"红头病"致病菌——鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)A86作为实验菌株,通过十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)抽提并结合超速离心的方法提取主要外膜蛋白(OMPs),SDS-PAGE图谱分析结果显示,OMPs主要有6条条带,相对分子质量分别为45 000、42 000、41 000、36 000、30 000和22 000。用A86 OMPs免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体22 mL,抗体效价为1∶20 480,抗体按照1∶2 560稀释时具有较高的特异性,仅与迟缓爱德华菌(E.tarda)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)存在微弱的交叉反应,与鮰爱德华菌参考株及不同地区的分离株呈现特异性结合。多克隆抗体与OMPs的免疫印迹结果显示,主要有2条明显的免疫反应发色带,相对分子质量分别为36 000和30 000,且36 000蛋白染色最为明显。多克隆抗体与包括菌株A86在内的分离自南北方不同地区的10株鮰爱德华菌全菌免疫印迹试验发现,所有受检菌株反应结果相同,主要有4条明显的反应条带,相对分子质量分别为106 000、54 000、36 000和30 000,其中36 000和30 000两条蛋白带染色最深。因此,认为从黄颡鱼体内分离的鮰爱德华菌OMPs中36 000和30 000蛋白具有很好的免疫原性,36 000蛋白尤甚。

鳗鲡病原菌二联外膜蛋白基因工程表达载体的构建

根据鳗鲡病原性嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白(porinⅡ)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白S(ompS2)的基因全长序列,分别选取这两个全长序列中表达其蛋白质膜外部分且理论免疫原性较好的两个基因片段,通过融合PCR技术连接这两个外膜蛋白基因片段.根据表达载体(pGEX-2T-His)的限制性酶切位点在连接序列片段的两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建了双外膜蛋白基因片段重组表达载体(pGEX-2T-His-porinⅡ-ompS2).表达载体理论表达产物的蛋白质结构预测表明表达产物无信号肽和跨膜区,不存在三级结构;亲水性和免疫原性预测分析表明该表达蛋白理论上为可溶性蛋白并具有丰富的抗原决定簇,本研究为该表达载体的蛋白表达、纯化以及表达产物的免疫原性研究奠定了基础.

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

迟缓爱德华菌的外膜蛋白图谱及耐药性分析

分析 2 7株不同来源的迟缓爱德华菌 (Et)的外膜蛋白 (OMP) ,可分为A～H 8个型。 2 1株致病株与 6株非致病株有明显不同的图谱。致病株OMP条带多而深浓 ,并且相同来源的菌株有几乎一致的图谱。其中国内致病株以E型为主 ,与ATCC参考株相似。非致病株OMP条带则浅而稀疏 ,来源虽不同 ,但图谱极类似。另外 ,6株非致病株对磺胺、庆大、四环素等抗生素普遍耐药 ,而致病株除少数几株外 。

迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC原核表达及免疫保护作用

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的免疫原性,用PCR方法扩增迟缓爱德华菌pagC基因,构建重组载体pET-32a-pagC,将其转化大肠埃希菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约40 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果该重组蛋白对免疫组小鼠具有95%的保护率。研究结果为重组PagC蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。

培养及提取条件对迟缓爱德华菌外膜蛋白的影响

提取迟缓爱德华菌 (Et)外膜蛋白 (OMP) ,经SDS PAGE分析发现 ,在不同培养温度、时间、pH值及不同培养基上OMP图谱无明显差异 ,主条带是 35 0 0 0和 40 0 0 0。但在铁限制环境下 ,增加了高分子区域带 980 0 0 ,930 0 0 ,75 80 0及72 40 0 ,而 45 0 0 0条带变细变浅。用去污剂TritonX 10 0和Sackosyl抽提OMP ,条带基本相似 ,后者主条带更浓密。用SDS抽提OMP ,则仅有 35 0 0 0条带。将OMP样品分别在 37,5 0 ,70 ,90及 10 0℃加热 5min后点样 ,45 0 0 0条带持续出现 ,35 0 0 0在 70℃以上开始出现 ,在 90℃和 10 0℃浓集 ,提示 35 0 0 0条带是热修饰微孔蛋白。

鳗鲡病原菌外膜蛋白三联表达载体的构建、表达与表达产物的纯化

为研制能同时预防鳗鲡3种常见病原菌感染的三联外膜蛋白疫苗,分别选择创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白的ompU、ompA和omp porinП基因,设计特异性引物后分别扩增基因中表达外膜蛋白膜外区域且抗原决定簇丰富的3个基因片段并通过融合PCR技术进行连接。根据表达载体(pGEX-2T-his)的限制性酶切位点,在连接片段的两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点,将3个外膜蛋白基因片段与质粒连接后成功构建了重组表达载体。重组表达载体成功转化大肠杆菌(E.coli BL21)后,当菌液浓度(D600nm)为0.8时加入0.25mmol/L IPTG,16℃培养过夜后得到了高效表达。表达产物用镍柱进行洗脱纯化后经梯度尿素复性获得了分子质量约85ku的高纯度蛋白。

鳗鲡迟缓爱德华氏菌偶联疫苗免疫效果评价

目的迟缓爱德华氏菌是目前水产养殖中主要的病原菌,其感染谱甚广,危害巨大。因此,研制能有效预防这种致病菌的疫苗,将会极大的促进水产养殖业的发展。方法用OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC(福尔马林灭活全菌)以及生理盐水对照组按相同程序分别免疫鳗鲡。通过溶菌酶活性检测、微量凝集反应试验,结果鳗鲡经OMP-LPS偶联物、OMP、LPS以及FKC疫苗免疫后,各免疫组间血清中溶菌酶活性没有显著差异(P>0.05),但均远高于生理盐水对照组(P<0.05);OMP-LPS偶联组抗迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的抗体效价较单纯的LPS组、OMP组,FKC组抗体滴度高,且持续时间长;对迟缓爱德华氏菌(E.tarda)E29L株的攻击,OMP-LPS偶联组保护率为84%,高于单纯OMP组的80%,LPS组的44%和FKC组60%。结论 OMP-LPS偶联物、OMP、LPS、FKC添加佐剂ISA763,各组的溶菌酶活性均显著高于不添加佐剂各组(P<0.05),除了FKC+ISA763佐剂组外,其余各组均与不添加佐剂各组差异极显著(P<0.01),且添加佐剂各组保护率都明显高于不添加佐剂各组,说明添加ISA763佐剂能够更好的启动鱼类的特异性和非特异性免疫。

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。

迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ原核表达及免疫原性

为研究迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌flgJ基因,构建重组载体pET-32a-flgJ,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约54 000;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌分离株ET-13进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为70%。本研究克隆了迟缓爱德华菌外膜蛋白flgJ基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组FlgJ蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

TolC是革兰阴性细菌一种外膜通道蛋白,参与细菌应对外界不利环境的耐受,沙门菌TolC蛋白作为免疫原对动物沙门菌感染的保护效果优良,具有潜在的应用价值。目前,迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)该蛋白的研究尚未见有报道,本研究以E.tarda TolC蛋白作为研究对象,原核表达并纯化TolC蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白具有较强的免疫原性,免疫动物对致病性E.tarda ET-13强毒株感染具有较高的抵抗力。结果表明,E.tarda TolC蛋白具有较强的免疫原性和潜在的疫苗价值,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供理论资料。

迟缓爱德华氏菌ETA1-L-GAPDH融合蛋白在大肠杆菌中的表达

迟缓爱德华氏菌是水产养殖中危害性极大的一种致病菌,该菌的两种外膜蛋白GAPDH和ETA1被证明可以独立产生免疫原性,具有开发成疫苗的潜力。文章将这两个蛋白融合表达以期增强疫苗的保护作用。采用PCR方法扩增出融合有gapdh基因和eta1基因的融合基因rh,将该目的基因与表达载体p ET-30a(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达融合蛋白,采用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,并用镍柱和葡聚糖凝胶Sephadex G-100对融合蛋白进行了纯化,最后通过Western-blot对纯化的融合蛋白进行了验证。结果表明融合蛋白主要以包涵体形式表达,在破碎后的菌体沉淀中该蛋白含量高达73.6%,经过纯化后的融合蛋白纯度高达90%,并通过Western-blot得到了验证。上述结果表明表达载体构建成功,目的蛋白在大肠杆菌中大量表达。

迟缓爱德华菌外膜蛋白FadL原核表达及免疫原性

FadL是革兰阴性细菌编码的外膜通道蛋白,参与长链脂肪酸的转运,沙门菌中该蛋白作为免疫原使用具有优良的保护效果。本试验以迟缓爱德华菌FadL蛋白作为研究对象,原核表达并纯化该蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白的免疫特性和免疫效果。结果显示,成功表达和纯化重组FadL蛋白(rFadL),蛋白大小为50 000。小鼠试验结果表明,rFadL免疫小鼠能产生高水平特异性抗体;斑马鱼感染试验结果表明,rFadL能够对斑马鱼迟缓爱德华菌产生一定免疫保护力,保护率可达55%。本试验揭示了迟缓爱德华菌FadL蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了参考和借鉴。