3株人源猪链球菌2型湖南株cps2J、gdh、ef基因进化分析

目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行分析。结果 cps2J、gdh、ef基因包含的完整开放阅读框(ORF)分别为999bp、1 347bp、2 532bp,分别编码333、448、843个氨基酸。在线BLAST同源性分析表明,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株属于S.suis 2,3菌株cps2J、gdh、ef基因组序列之间的核苷酸同源性均为100%;进化树显示,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株与国内外猪源和人源S.suis 2菌株属于同一分支,同源性比较显示3株S.suis 2湖南分离株cps2J、gdh、ef基因与其他国内外S.suis株核苷酸序列同源性分别为99.8%～100%、96.4%～100%和99.7%～100%,氨基酸同源性分别为98.5%～100%、98.7%～100%和99.5%～100%。结论 3株人源S.suis 2湖南株cps2J、gdh、ef基因序列与国内外S.suis 2菌株相应基因序列同源性高,变异程度小。

猪链球菌细胞外蛋白因子Ef基因的克隆与原核表达

采用分子克隆手段,将Ef全长基因克隆至表达载体pGEX-6p-1的Ptac启动子下游,电击转入大肠杆菌E.cohi BL21(DE3)中表达。经PCR扩增和蛋白质凝胶电泳鉴定,表明该EF蛋白获得有效表达,为进一步构建猪链球菌Ⅱ生物工程疫苗提供前期载体。

4株猪链球菌2型分离株主要毒力因子(MRP、EF)的全基因序列分析

猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人兽共患病病原菌，溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）是其重要的2种毒力因子。参照GenBank上已发表的MRP和EF基因序列，设计引物，对4株国内SS2分离株进行MRP和EF全基因序列测定并进行分析。结果表明：4株SS2国内分离株MRP基因的完整开放阅读框（ORF）都为3771bp、编码1256个氨基酸，EF基因的完整ORF都为2532bp，编码843个氨基酸；与国外参考株D282之间的MRP核苷酸和蛋白质的同源性都为99．9％。EF核苷酸的同源性为99．9％、蛋白质的同源性为99．5％～100．0％。

香樟延伸因子EF1a基因片段的克隆及表达分析

通过同源克隆的方法从香樟Cinnamomum camphora中分离到一个编码延伸因子EF1a的c DNA序列片段。根据已经在Gen Bank中登录的其它物种的EF1a基因的保守序列设计一对兼并引物,通过反转录PCR技术获得一个1 297 bp的基因片段。同源比对表明:Cc EF1a与Gen Bank中注册的其它植物EF1a基因核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。将所获得基因片段命名为Cc EF1a并提交Gen Bank,登录号为KM086740。实时定量PCR结果显示,Cc EF1a在低温胁迫下的叶片中表达量稳定,可以在实时定量PCR分析中作为内参基因。

能源植物续随子延伸因子EF1A基因cDNA序列的克隆及分析

利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到能源植物续随子延伸因子EFIA基因的cDNA序列(命名为ElEF1A,GenBank登录号为KT892703)。序列分析表明,ElEF1A编码序列(CDS)长1344bp,编码447个氨基酸,氨基酸序列具有典型的EF1-alpha、EF1-alpha-Ⅱ和EF1-alpha-Ⅲ结构域。ElEF1A与其他植物EF1A基因的核苷酸序列同源性达到88%以上,推导的氨基酸序列的同源性达95%以上。

犬源贾第虫EF1α基因的克隆及序列分析

以广州某宠物医院临床犬源贾第虫为研究对象,根据GenBank TM中登录的贾第虫EF1α基因序列(AF069575),设计1对引物EF/ER,采用PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对其进行序列测定及分析,旨在对广州犬源贾第虫进行分子鉴定。结果显示,该犬源贾第虫EF1α序列长为288bp,与预期目的片段一致,该序列构建的分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。说明EF1α适合做分子标记,可准确地对贾第虫进行基因分型,为贾第虫分子分类学及分子遗传学研究奠定了基础。

致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因的克隆与生物信息学分析

为研究致羔羊脑炎粪肠球菌分离株表面蛋白EF3183基因的结构及功能,采用PCR方法扩增EF3183基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其分子结构,推测其生物学功能,并构建系统进化树。结果显示:成功获得了长1060 bp的表面蛋白EF3183基因;经生物信息学分析,此序列包含有1个1056 bp的完整开放阅读框,编码351个氨基酸;无信号肽;有2个跨膜区;抗原表位预测显示表面蛋白EF3183有15个抗原表位;系统进化树分析显示致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因与粪肠球菌v583的EF3183基因的进化距离最近。本研究成功获得了致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。

猫源贾第虫EF1α和GDH基因的扩增与分析

为研究猫源蓝氏贾第虫EF1α和GDH基因的分子特性,本研究采用两组引物EF1-F、EF1-R和GDHeF、GDHiF、GDHiR通过普通PCR及套式PCR方法对两基因片段进行特异性扩增,用MegAlign软件对扩增片段进行同源性比对及进化树分析。结果显示,获得了200 bp及432 bp的EF1α和GDH序列,其基因登录号分别为KC510661和KC510662,EF1α基因位点分析表明该蓝氏贾第虫分离株为基因型F,GDH基因位点分析表明其可能是一个新亚型(FIII)。该研究首次对猫源蓝氏贾第虫EF1α和GHD基因双位点进行分子特性研究,为贾第虫分子分类学及分子遗传学研究奠定了基础。

猪链球菌EF基因的PCR扩增

了解近年来猪链球菌甘肃分离株的毒力基因--细胞外蛋白因子(EF)的分布情况,为猪链球菌EF基因的功能研究奠定基础。成功检测出甘肃分离株中所含的EF基因,其检测的EF片段大小与预期结果相符。

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ，并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点，经限制酶谱分析，构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上，同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中，最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。

云南葡萄炭疽病菌遗传多样性分析

本研究利用β-tub2,ef1-α和his4基因部分序列对60株采自云南省不同葡萄产区的葡萄炭疽病菌菌株进行基因谱系分析。结果表明:引起云南葡萄炭疽病的病原菌种类较为复杂,不仅包括胶孢炭疽菌复合种群中的Colletotrichum gloeosporioides,还有胶孢炭疽菌复合种群中的其他种或炭疽菌属其他种。来源于不同产地不同葡萄品种上的炭疽菌遗传多样性丰富,但分子水平的多样性与菌株的地理来源、寄主种类、形态特征及对红提致病力方面无明显相关性。

双色实时荧光聚合酶链式反应法检测产玉米赤霉烯酮毒素的黄色镰孢菌

目的建立双色实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法同时检测黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)及其所产玉米赤霉烯酮毒素合成基因的方法。方法依据EF1α基因和PKS基因,优化建立双色实时荧光PCR反应体系和扩增条件;建立粮食霉变模型,检测霉变粮食中产毒真菌,验证方法的特异性、灵敏度和重复性。结果应用本研究设计的引物和探针,仅产玉米赤霉烯酮毒素的黄色镰孢菌EF1α和PKS基因出现特异性扩增,其余真菌扩增结果均为阴性;检出限达3.5×10^(2)CFU/mL,重复性良好;且采用此方法对粮食霉变模型中选取的样品进行检测,可检出产玉米赤霉烯酮的黄色镰孢菌。结论该方法可准确鉴定霉变粮食中的产玉米赤霉烯酮毒素的黄色镰孢菌,实现在真菌毒素未产生前或者产生早期,对粮食受真菌及真菌毒素污染的情况进行早期监控。

猪链球菌2型浙江嘉兴株毒力基因序列分析

目的猪链球菌2型(SS2)浙江嘉兴ZJJX2008分离株毒力基因序列测定与分析。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J和EF基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并与国内外其他分离株基因进行比较。结果 Cps2J、EF基因完整开放阅读框(ORF)分别为999,2532bp,各自编码333,843个氨基酸,ZJJX2008分离株Cps2J、EF基因与国内外SS2菌株核苷酸同源性分别为99.1%～100%和99.8%～99.9%,氨基酸同源性分别为99.2%～99.7%和99.3%～99.5%;ZJJX2008分离株Cps2J基因与猪链球菌1型荷兰分离株6555核苷酸和氨基酸同源性只有66.7%和51.8%。结论 ZJJX2008分离株为猪链球菌2型菌株,Cps2J、EF基因与国内外其他SS2分离株比较序列非常保守,变异不大。

苏州市入侵福寿螺的遗传多样性

福寿螺属(Pomacea)中的小管福寿螺(P.canaliculata)和斑点福寿螺(P.maculata)形态相似,入侵能力很强,严重危害水稻和其他水生植物。本研究基于线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因和核基因EF1α序列,应用软件DnaSP 5.0、Arlequin 3.1.1、MEGA 7.0和PhyloSuite进行遗传参数统计、构建贝叶斯系统发育树,分析了来自江苏省苏州市虎丘区、吴中区、昆山周市镇、千灯镇和玉山镇共5个采样地的40只福寿螺(Pomacea spp.)的种类及其遗传多样性。结果表明,获得40条长度为605 bp的线粒体COI基因序列,经序列比对后发现有74个变异位点、4种单倍型。小管福寿螺有34只,分属3种单倍型(PcaH1~PcaH3),小管福寿螺的单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)分别为0.399和0.017。斑点福寿螺有6只,仅有1种单倍型(PmaH1)。苏州地区小管福寿螺和斑点福寿螺遗传多样性均较低。基于线粒体COI基因系统发育分析结果表明,苏州市的小管福寿螺可能与阿根廷的小管福寿螺亲缘关系较近,而苏州市的斑点福寿螺可能与巴西的斑点福寿螺亲缘关系较近。此外,昆山市周市镇是新发现的小管福寿螺和斑点福寿螺同域分布地区。苏州、昆山的9个福寿螺样本共获得430 bp的核基因EF1α序列28条,发现有40个变异位点和9种单倍型(EFHAP1~EFHAP9),其中,小管福寿螺有8种单倍型(EFHAP1~EFHAP5和EFHAP7~EFHAP9),斑点福寿螺有2种单倍型(EFHAP5和EFHAP6)。基于线粒体COI基因和核基因EF1α序列构建的系统发育树,小管福寿螺和斑点福寿螺存在遗传信息混杂的现象,提示两种螺存在杂交。