胡萝卜14-3-3基因家族的鉴定与分析

以胡萝卜为试材,采用分子生物学和生物信息学方法对胡萝卜14-3-3基因家族各成员进行鉴定,研究分析其理化特性、基因结构、保守结构域、复制事件、系统进化及顺式作用元件,以期为进一步研究胡萝卜14-3-3蛋白的功能提供参考依据。结果表明:胡萝卜中共鉴定到11个14-3-3基因,不均匀分布在6条染色体上,含有3~7个外显子,其中1对基因发生片段复制事件;编码的蛋白序列长度为236~264 aa,分子量为26.64~30.14 kD,等电点为4.65~5.33,具有7个Motif,全部为酸性非分泌型蛋白,定位在细胞核。系统进化分析显示,胡萝卜14-3-3蛋白分为ε类(3个)与非ε(8个)类2个亚族。此外,顺式作用元件分析结果表明,胡萝卜14-3-3基因含有大量激素与逆境胁迫相关元件。

川芎嗪通过miR-143-3p靶向调节LIMK1/cofilin通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

目的 探究川芎嗪(TMP)通过miR-143-3p靶向调节LIM激酶1/丝切蛋白(LIMK1/cofilin)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的影响。方法 将C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON组)、模型组(LPS组)、TMP组、空载病毒组(GFP组)、过表达miR-143-3p组、敲低miR-143-3p组,每组10只。HE染色观察肺组织病理变化情况;ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;肺湿/干比(肺W/D)、BALF中白细胞数量、蛋白浓度以及埃文斯蓝(Evans Blue)染料检测肺血管通透性;Western Blot检测p-LIMK1、p-cofilin的表达情况。结果 与CON组相比,LPS组肺组织病理损伤加重,肺损伤评分、肺W/D、BALF白细胞数量、蛋白浓度和炎症因子、Evans Blue渗漏、p-LIMK1、p-cofilin表达水平增加(P均<0.01);与LPS组相比,过表达miR-143-3p组肺组织病理损伤减轻,肺损伤评分、BALF白细胞数量、蛋白浓度和炎症因子、Evans Blue渗漏降低(P均<0.01),肺W/D降低(P<0.05),p-LIMK1、p-cofilin表达水平降低(P<0.01,P<0.05);与LPS组相比,TMP组肺组织病理损伤减轻,肺损伤评分、肺W/D、BALF白细胞数量、蛋白浓度和炎症因子、Evans Blue渗漏降低(P均<0.01),p-LIMK1、p-cofilin表达水平降低(P<0.01,P<0.05);与TMP组相比,敲低miR-143-3p组逆转了TMP对LPS诱导的小鼠ALI的改善作用(P均<0.01)。双荧光素酶实验证实miR-143-3p可靶向调控LIMK1表达(P<0.001)。结论 TMP通过上调miR-143-3p来抑制LIMK1/cofilin信号通路,从而减轻LPS诱导的小鼠ALI。

多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞miR-144-3p及其靶基因PTEN的表达及作用研究

目的探讨多囊卵巢综合征患者(polycystic ovary syndrome,PCOS)卵巢颗粒细胞miR-144-3p及其靶基因PTEN的表达及作用。方法选取2020年10月至2022年3月在淮安市妇幼保健院生殖医学科行IVF/ICSI治疗的20例PCOS患者作为研究对象即为PCOS组,选取行IVF/ICSI治疗的输卵管因素或男方因素患者20例作为对照组。收集两组患者颗粒细胞,并分析颗粒细胞miR-144-3p的表达情况。利用Tar-getScan数据库预测miR-144-3p的靶基因,并采用双荧光素酶活性检测验证靶基因。复苏人卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells,KGN),转染并建立miR-144-3p模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-144-3p抑制物组、抑制物阴性对照组、si-PTEN和siRNA-NC组。采用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡情况,RT-PCR及蛋白质印迹技术检测颗粒细胞中miR-144-3p、PTEN mRNA及蛋白的表达情况。结果RT-PCR结果显示P-COS组miR-144-3p表达水平显著低于对照组(P<0.05),流式细胞仪检测结果显示miR-144-3p mimic组的颗粒细胞凋亡百分比显著低于mimic-NC组(P<0.05),miR-144-3p inhibitor组颗粒细胞凋亡水平显著高于inhibitor-NC组(P<0.05)。生物信息学预测miR-144-3p的靶基因为PTEN,荧光素酶结合实验证实miR-144-3p能特异结合PTEN-3′UTR并下调PTEN基因表达。RT-PCR测定结果显示PCOS组PTEN mRNA表达显著高于对照组(P<0.05),且与miR-144-3p表达水平呈负相关(r=-0.91,P<0.001)。qRT-PCR及蛋白质印迹检测结果显示与mimic NC组相比,miR-144-3p mimic组中PTEN mRNA及蛋白表达量显著低于mimic NC组(P<0.05)。miR-144-3p inhibitor组PTEN mRNA及蛋白表达量显著高于inhibitor NC组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示si-PTEN组颗粒细胞凋亡水平显著低于siRNA-NC组(P<0.05),而miR-144-3p inhibitor+si-PTEN组的颗粒细胞凋亡比例显著低于miR-144-3p inhibitor组(P<0.05)。结论PCOS患者卵巢颗粒细胞miR-144-3p表达水平显著降低,而PTEN基因表达水平显著增高,进而促进PCOS患者卵巢颗粒细胞凋亡。

MnCe-Al_(2)O_(3)球形颗粒的制备及其催化燃烧环己烷性能

挥发性有机物(VOCs)的大量排放会导致环境污染和健康危害,催化燃烧是高效降解VOCs的重要手段之一.采用海藻酸盐溶胶-凝胶法合成了MnCe-Al_(2)O_(3)球形颗粒作为环己烷催化燃烧催化剂,结果表明,Mn催化剂中适当添加Ce可提高MnOx的分散性,降低催化剂H_(2)-TPR还原温度.催化剂中Mn和Ce摩尔比为3∶1、煅烧温度650℃时,催化剂催化燃烧环己烷活性最高,可以在345℃实现环己烷的完全转化.反应24 h后,催化剂仍显示出几乎100%的环己烷转化率,表现了良好的催化稳定性.与浸渍法制备的催化剂相比,MnCe-31-Al_(2)O_(3)-650催化剂活性更高.

基于KY3H中医体质辨识-评估-干预系统辨证治疗先兆流产临床研究

目的:观察在常规治疗基础上基于KY3H中医体质辨识-评估-干预系统辨证治疗先兆流产的临床疗效。方法:选取2022年7月—2023年6月在浙江中医药大学附属温州市中医院治疗的600例先兆流产患者,以随机数字表法分为对照组与观察组各300例。对照组予以常规治疗,观察组在对照组基础上根据体质类型针对性给予中药汤剂治疗。2组均治疗2周。比较2组临床疗效、性激素水平及保胎成功率。结果:治疗2周后,总有效率观察组93.00%(279/300),高于对照组87.67%(263/300),差异有统计学意义(P<0.05)。2组血清孕酮(P)、雌二醇(E2)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平均较治疗前升高,观察组血清P、E2、HCG水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。保胎成功率观察组90.67%(272/300),高于对照组83.67%(251/300),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在常规治疗基础上基于KY3H中医体质辨识-评估-干预系统辨证治疗先兆流产能提高P、E2、HCG水平,改善妊娠结局。

长链非编码RNA LINC00926调控微小RNA-331-3p对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00926对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响及分子机制。方法:前列腺癌组织和癌旁组织LINC00926表达用LncRNADisease数据库分析。采用RT-qPCR检测正常前列腺上皮RWPE-1细胞和前列腺癌细胞株22Rv1、PC3、C4-2B、LNCaP、DU-145中LINC00926的表达。选取LINC00926表达最高的前列腺癌DU-145细胞,分别转染LINC00926小干扰RNA(si-LINC00926组)和阴性对照RNA(si-NC组)。采用CCK-8法、划痕实验检测DU-145细胞增殖和迁移能力。双荧光素酶报告基因实验检测LINC00926与miR-331-3p的靶向结合。采用RT-qPCR检测DU-145细胞中miR-331-3p表达。采用Western blot检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关蛋白表达。结果:前列腺癌组织LINC00926表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。与RWPE-1细胞比较,LINC00926在前列腺癌22Rv1、PC3、DU-145、C4-2B、LNCaP细胞中表达水平升高,且DU-145细胞表达最高(均P<0.05)。si-NC组LINC00926表达水平高于si-LINC00926组(P<0.05)。于24、48、72、96 h,si-LINC00926组DU-145细胞增殖能力低于si-NC组(均P<0.05)。与si-NC组比较,si-LINC00926组DU-145细胞迁移能力下降(P<0.05)。LINC00926-WT和miR-331-3p共转染荧光素酶相对活性低于LINC00926-WT和miR-NC共转染(P<0.05)。si-NC组miR-331-3p表达水平低于si-LINC00926组(P<0.05)。与si-NC组比较,si-LINC00926组DU-145细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、细胞髓细胞瘤病毒癌基因同源物蛋白(c-myc)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖激酶3(CDK3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论:LINC00926在前列腺癌组织和细胞中高表达,下调LINC00926可能通过靶向miR-331-3p抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。

烟粉虱MED隐种14-3-3基因克隆及时空表达谱分析

【目的】真核生物中,14-3-3蛋白是一类可与多种蛋白互作的调节蛋白,能够参与信号转导、免疫反应、生长发育和胁迫响应等。本研究旨在克隆烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种的14-3-3基因的全长cDNA序列,了解该基因编码的蛋白特征和该基因的时空表达模式。【方法】使用RT-PCR技术克隆烟粉虱MED隐种的14-3-3基因全长cDNA序列,通过生物信息学软件和在线网站分析14-3-3基因的生物学特性;使用RT-qPCR测定14-3-3基因在烟粉虱MED隐种不同发育阶段(卵、1-4龄若虫和成虫)、雌雄成虫以及雌成虫头、胸和腹中的表达量。【结果】克隆并鉴定了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型:Bt14-3-3 epsilon(GenBank登录号:XM_019046102.1)和Bt14-3-3 zeta(GenBank登录号:XM_019057395.1),开放阅读框(ORFs)分别长771和744 bp,分别编码256和247个氨基酸,编码的蛋白是无跨膜螺旋区和信号肽的亲水性蛋白,其二级结构主要由α旋螺旋组成。系统发育树分析表明,Bt14-3-3 epsilon与褐飞虱Nilaparvata lugens、温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的14-3-3 epsilon聚为一支,同源性较高;Bt14-3-3 zeta与褐飞虱的14-3-3 zeta的亲缘关系更近。RT-qPCR结果表明,Bt14-3-3 epsilon和Bt14-3-3 zeta在烟粉虱MED隐种的卵、雌成虫和雌成虫腹部中的表达量较高。【结论】明确了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型的全长序列、编码蛋白特征及时空表达特点,为后续研究14-3-3蛋白的分子功能奠定了基础。

血清半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和可溶性血管内皮生长因子受体-1水平与突发性耳聋患者病情及预后的关系分析

目的探讨血清半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFIt-1)水平与突发性耳聋患者病情及预后的关系。方法选取2022年1月至2024年1月陕西省人民医院收治的78例突发性耳聋患者作为研究组。男46例,女32例;年龄32~76(47.92±4.65)岁;体重指数20.37~27.94(24.57±3.24)kg/m^(2)。另外,选取同期38例体检健康志愿者作为参照组,男21例,女17例,年龄34~63(48.23±4.81)岁;体重指数19.86~22.51(20.87±2.39)kg/m^(2)。采用纯音测听检查评估突发性耳聋患者病情,并根据严重程度进行分组,重度组16例[纯音平均听阈(PTA)>60 dBHL]、中度组39例(PTA>40~60 dBHL)、轻度组23例(PTA 20~40 dBHL)。所有患者均给予激素、营养神经等治疗,10 d为1个疗程,10 d后评估患者预后。根据预后情况将治疗后突发性耳聋患者分为预后良好组(57例)和预后不良组(21例)。采用酶联免疫吸附法检测受试者血清Caspase-3、sFIt-1水平。收集受试者一般资料,包括性别、年龄、体重指数、病程、临床症状、耳聋部位、听力损失程度、基础疾病等。采用独立样本t检验、重复测量方差分析和χ2检验进行统计学分析。采用Spearman秩相关系数进行相关性分析。采用多因素logistic回归分析突发性耳聋患者预后的影响因素。采用受试者操作特征曲线(ROC)分析血清Caspase-3、sFIt-1水平对突发性耳聋患者预后的预测效能。结果研究组血清Caspase-3、sFIt-1水平均高于参照组[(17.27±3.14)ng/L比(6.63±1.67)ng/L、(157.82±13.47)ng/L比(81.67±10.63)ng/L](均P<0.05)。重度、中度组Caspase-3、sFIt-1水平均高于轻度组,重度组上述指标均高于中度组(均P<0.05)。Spearman相关性分析显示,突发性耳聋患者血清Caspase-3、sFIt-1水平与病情严重程度呈正相关(r=0.881、0.841,均P<0.05)。预后不良组和预后良好组年龄、听力损伤程度、血清Caspase-3、sFIt-1水平比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,听力损失程度(OR:0.009,95%CI:0.000~0.209)、年龄(OR:1.165,95%CI:1.049~1.293)、血清Caspase-3(OR:1.546,95%CI:1.183~2.022)、sFIt-1(OR:1.058,95%CI:1.015~1.104)水平均是突发性耳聋患者预后的影响因素(均P<0.05)。ROC分析结果显示,血清Caspase-3、sFIt-1水平联合预测的曲线下面积(AUC)大于血清Caspase-3、sFIt-1水平单独预测。其中联合预测灵敏度66.67%,特异度87.72%,AUC为0.819(0.712~0.925);Caspase-3灵敏度52.38%,特异度82.46%,AUC为0.721(0.593~0.849);sFIt-1灵敏度52.38%,特异度84.21%,AUC为0.703(0.573~0.832)。结论血清Caspase-3、sFlt-1水平升高可反映突发性耳聋患者病情严重程度,二者联合检测可更准确评估患者预后情况。

菊芋14-3-3基因家族的鉴定及其对非生物胁迫响应的分析

[目的]本文旨在鉴定菊芋14-3-3基因家族成员并分析它们对高温、低温、盐和干旱胁迫响应的表达模式,为研究14-3-3蛋白功能及菊芋育种提供依据。[方法]采用克隆和生物信息学研究基因性质,采用RNA-seq数据分析和RT-qPCR研究基因对非生物胁迫的响应模式。[结果]从菊芋中克隆到14-3-3基因家族的10个成员HtGRF1—HtGRF10,GenBank登录号为OP132618—OP132627。根据进化关系将其分为2个亚家族:HtGRF1—HtGRF7属于非ε组,HtGRF8—HtGRF10属于ε组,通常形成同源或异源二聚体。组织表达分析表明,HtGRF2/3/6/9在芽、根、茎、叶中的表达丰度较高,HtGRF3/5/9在块茎发育过程中前高后低。综合分析根和叶中HtGRF对非生物胁迫响应时发现,HtGRF6表达水平在高温、盐和干旱胁迫下下降;HtGRF2/3/7/8/9表达水平在盐胁迫下下降,而在干旱胁迫下上升;HtGRF1表达水平在低温胁迫下上升;HtGRF4/5表达水平在干旱胁迫下下降;而HtGRF10表达水平变化不显著。[结论]菊芋14-3-3蛋白是一个高度保守的多基因编码家族,在菊芋的生长发育和适应复杂环境中起着重要作用。

铁皮石斛14-3-3基因家族鉴定及表达分析

【目的】14-3-3蛋白,亦称通用调节因子(GRF),由多基因家族编码,在植物生长发育和逆境应答发挥关键的作用。鉴定铁皮石斛(Dendrobium officinale)GRF基因家族,为铁皮石斛GRF基因功能研究及遗传改良提供理论依据。【方法】通过生物信息学的方法鉴定铁皮石斛14-3-3家族成员,分析其理化性质、染色体定位、系统进化发育、基因结构和启动子顺式作用元件等,同时通过荧光定量PCR技术检测它们在不同组织、低温处理及盐胁迫处理后的表达量。【结果】铁皮石斛有17个GRF家族成员,分为ε类和非ε类亚族,不均匀地分布在7条染色体上,且存在7对串联复制基因。同一亚族成员基因结构、保守基序和蛋白质二级结构相类似。DoGRF家族基因的启动子区域存在大量激素和环境胁迫应答相关的调控元件。DoGRF家族基因在铁皮石斛各组织中均有表达,具有组织表达特异性,大多数基因在花器官中表达最高,其次是茎和根。同时,在低温处理、盐胁迫处理下呈现差异化表达,可能受到低温和盐胁迫的调控,特别是DoGRF2在铁皮石斛逆境应答过程中起着关键的作用。【结论】在全基因组水平从铁皮石斛中鉴定出17个DoGRF家族成员,不同基因对非生物胁迫响应不一,并具有器官表达特异性。DoGRF2对低温和盐胁迫呈现正向响应。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

肿瘤组织微小RNA-542-3p、血管细胞黏附分子-1表达特征与脑胶质瘤术后复发的关系及预测价值

目的:探讨肿瘤组织中微小RNA-542-3p(miR-542-3p)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达与脑胶质瘤手术后复发的关系及其预测价值。方法:选取实施手术治疗的脑胶质瘤患者91例进行临床研究,其中43例患者于术后1年出现术后复发(复发组)、48例患者手术后1年检查未出现复发病灶(非复发组),对比两组第一次手术后病灶组织标本中的miR-542-3p、VCAM-1蛋白表达差异,并分析miR-542-3p、VCAM-1蛋白表达与胶质瘤术后复发的关系及其预测复发的价值。结果:复发组患者脑胶质瘤组织中miR-542-3p表达水平低于非复发组,复发组患者脑胶质瘤组织中VCAM-1蛋白阳性表达率高于非复发组,差异具有统计学意义(均P<0.05);复发组患者脑胶质瘤组织病理学分级≥Ⅲ级患者占比、低分化患者占比、非全切手术方式患者占比、肿瘤浸润率均高于非复发组,复发组患者术后放化疗患者占比低于非复发组,差异具有统计学意义(均P<0.05)。miR-542-3p表达降低、VCAM-1蛋白阳性表达、手术范围非全切是脑胶质瘤手术后复发的独立危险因素(均P<0.05);miR-542-3p表达、VCAM-1蛋白预测脑胶质瘤手术后复发的曲线下面积AUC值分别为0.784(95%CI:0.690~0.877)、0.725(95%CI:0.621~0.829)。结论:脑胶质瘤组织中miR-542-3p表达、VCAM-1蛋白表达与肿瘤手术后复发有密切关系,用于临床预测有一定的参考价值。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠发病中Tim-3的表达及其作用

目的探讨T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)发病中的表达和作用。方法选取4~5周龄雄性C57BL/6J小鼠共12只;采用随机数字表法将12只小鼠分为对照组(3只)和实验组(9只)。对照组(造模时间节点为造模后0 d)不做任何处理,实验组小鼠诱导建立EAU模型(按造模时间节点分为造模后7 d、14 d、21 d三个小组,每组3只小鼠)。将光感受器间维生素A类结合蛋白651-670和完全弗氏佐剂充分混合乳化后,在实验组小鼠的双侧大腿、尾根部及颈后部皮下注射配制好的免疫乳剂(每只注射200μL免疫乳剂,含500μg光感受器间维生素A类结合蛋白651-670),随后实验组每只小鼠腹腔注射1μg百日咳毒素。通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节及眼底表现并采集图像。根据炎症程度采用Caspi分级标准对小鼠行临床评分及组织病理学评分。ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ、IL-17的表达;实时荧光定量PCR法检测小鼠脾脏及眼球组织中Tim-3 mRNA的表达;Western blot法检测Tim-3蛋白的表达;免疫组织化学法检测脾脏组织Tim-3蛋白的表达。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析。结果造模后小鼠的眼前节临床评分、眼底临床评分、组织病理学评分均随造模后时间的延长呈升高趋势,各组间的评分差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后小鼠血清中IFN-γ、IL-17的表达量均随造模后时间的延长呈升高趋势,且各组间的差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后小鼠脾脏与眼球组织中Tim-3 mRNA的相对表达量均随造模后时间的延长呈下降趋势,且各组间的差异均有统计学意义(均为P<0.05)。小鼠眼球和脾脏组织中Tim-3蛋白的表达情况和mRNA相同。结论Tim-3在EAU发病进程中的表达随着炎症的加重呈下调趋势,Tim-3在葡萄膜炎发病进程中可能发挥着负性免疫调控作用。

铝源和pH值对溶胶-凝胶法制备α-Al_(2)O_(3)粉体的影响

本文以硫酸铝、硝酸铝和氨水为原料,通过溶胶-凝胶法制备了形貌规则的α-Al_(2)O_(3)粉体。采用X射线衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、热重-差示扫描量热仪(TG-DSC)和傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)系统地研究了不同铝盐质量比和溶液的pH值对氧化铝粉体物相组成、形貌和分散性的影响。结果表明,通过调节硝酸铝和硫酸铝的质量比可以改变α-Al_(2)O_(3)粉体的分散性和形貌。其中,硫酸根离子的加入使得氢氧化铝前驱体转变为勃姆石相,且制得的α-Al_(2)O_(3)粉体形貌规则。随着pH值的升高,前驱体物相由无定形氢氧化铝经勃姆石相转变为拜耳石相,且制得的α-Al_(2)O_(3)粉体团聚严重。当硝酸铝和硫酸铝的质量分数分别为75%和25%,溶液pH值为7时,前驱体在1200℃下加热2 h,能够制得分散性良好、形貌规则的α-Al_(2)O_(3)粉体。

基于超高通量筛选的D-阿洛酮糖3-差向异构酶定向进化

D-阿洛酮糖是一种低热量的甜味剂,具有多种生理功能,如维持血糖平衡和调节脂质代谢等。目前,D-阿洛酮糖工业生产主要通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase,DAEase)催化D-果糖的差向异构反应实现,但DAEase的应用性能仍需进一步提升以满足日益增长的市场需求。定向进化作为一种有效的分子改造策略,其筛选方法是限制效率的关键因素之一。通过构建并优化D-阿洛酮糖特异型生物传感器,结合微孔板筛选,对来自Clostridium cellulolyticum H10的DAEase(Cc DAEase)突变体文库进行超高通量筛选,最终获得了比活提高14.6%的优势突变体H209Q,其最适温度为60℃,最适pH值为7.5,并进一步解析了该突变体的构效关系。该研究证明了转录因子型生物传感器可以作为一种有效的定向进化筛选工具,为进一步优化DAEase的性能提供了可能性,亦为D-阿洛酮糖的工业制备提供了理论依据和技术支撑。

miR-155-5p介导PIK3R1负调控PI3K/AKT信号通路促进原发性干燥综合征人唾液腺上皮细胞增殖

目的探讨miR-155-5p靶向作用于PIK3R1调控PI3K/AKT信号通路对原发性干燥综合征人唾液腺上皮细胞(pSSHSGECs)的影响。方法通过双荧光素酶验证miR-155-5p与PI3K/AKT通路的靶向关系。利用TRAIL及INF-γ刺激细胞,模拟pSS-HSGECs细胞模型;空白组:HSGECs,模型组:TRAIL+INF-γ+HSGECs,空转组:TRAIL+INF-γ+HSGECs+miR-155-inhibitor-NC;miR-155抑制组:TRAIL+INF-γ+IHSGECs+miR-155-inhibitor;CKK-8法、流式细胞术、平板克隆形成实验分别检测细胞活力、细胞周期及凋亡率、细胞增殖能力。ELISA、RT-PCR方法分别检测相关细胞因子、miR-155-5p表达。蛋白质免疫印迹法检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达。结果双荧光素酶检测结果表明,miR-155-5p与PI3K/AKT通路存在靶向关系,且PIK3R1mRNA为二者的结合位点。与空白组相比,模型组细胞活力、细胞克隆形成能力、IL-10、IL-4水平降低;细胞凋亡率、细胞周期G2期比例、TNF-α、IL-6、miR-155-5p、PIK3R1 mRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比率、PIK3R1mRNA蛋白相对表达显著升高(P<0.01)。与模型组及空转组相比,miR-155抑制组细胞活力、G1期比例、克隆形成能力、IL-10和IL-4水平上升;同时细胞凋亡率、细胞周期G2期比例、TNF-α、IL-6、miR-155-5p、PIK3R1 mRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比率及PIK3R1蛋白相对表达下降(P<0.05)。结论miR-155-5p可靶向作用于PI3K1mRNA,负向调节PI3K/AKT信号通路的过表达,改善pSSHSGECs增殖与凋亡异常,调节炎症反应。

生物聚合物聚-3-羟基丁酸酯的酶法提取纯化研究

通过酶解法从嗜盐菌发酵液中获得高纯度、高分子质量的聚-3-羟基丁酸酯(PHB),分别采用高温处理与胞壁酸酶酶解2种方法对嗜盐菌细胞进行破壁,再通过中碱性蛋白酶进一步酶解纯化。结果表明,121℃下高温处理可有效实现嗜盐菌细胞破壁,但高温环境使PHB分子质量降低了30%~40%;在50℃、pH 6条件下添加0.3%胞壁酸酶酶解60 min破壁效果最好,且分子质量可维持在10%以内;在70℃、pH 10条件下添加0.045%中碱性蛋白酶酶解60 min纯化效果最好,所得PHB纯度可达97%以上。最后与市售PHB进行对比,确认了所得PHB的化学结构及热性能。酶的特异性水解保证了PHB结构不受破坏,胞壁酸酶-中碱性蛋白酶结合酶解法可以得到高纯度、高分子质量的PHB,无需其他化学试剂辅助。

谷氨酸棒杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶的定向进化改造研究

3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH)是L-丝氨酸生物合成途径的限速酶,是影响L-丝氨酸高效合成的关键。该研究以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PGDH为研究对象,通过对其酶学性质进行测试分析发现,Cg-PGDH的酶活性仅为1.98 U/mg,而且热稳定性较差,严重制约了L-丝氨酸的高效生物合成。针对这一关键问题,该研究采用定向进化和高通量筛选的方法对Cg-PGDH进行改造,提高酶的催化活性和热稳定性。通过多轮筛选,最终获得了5个催化活性显著提升的突变体,P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V。其中,突变体P85Q的酶活性提升了1.55倍,并显著提高了酶的温度稳定性,最适催化温度达到60℃。随后该研究对P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V等5个突变体的突变位点进行组合突变,获得了温度稳定性进一步提高的突变体P85Q-D365Y。通过对Cg-PGDH突变位点的三维结构解析和分子动力学模拟实验发现,尽管突变体P85Q与D365Y的突变位点不位于Cg-PGDH催化活性中心,但是可通过蛋白结构形变增强Cg-PGDH活性中心130~140区间loop的稳定性,从而增加了酶的底物亲和性和催化活性。相关研究成果为进一步解析PGDH催化机制,提高PGDH催化活性提供了重要的研究基础和方向。

电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

背景:越来越多的动物实验和临床研究证实电刺激可以促进周围神经损伤修复,具体的机制尚未完全明确。目的:探讨电刺激诱导miR-741-3p调控Radil对施万细胞迁移的影响。方法:①12只雄性SD大鼠,随机分为电刺激组和对照组,电刺激组在坐骨神经挤压伤后连续电刺激7 d,对照组在坐骨神经挤压后不做任何处理。术后第7天取损伤处神经,利用荧光原位杂交技术检测两组miR-741-3p的表达差异。②通过miRDB、TargetScan和miRWalk数据库预测miR-741-3p靶基因。③将miR-741-3p模拟物及其对照、miR-741-3p抑制物及其对照、Radil siRNA及其对照、miR-741-3p抑制物+Radil siRNA及miR-741-3p抑制物+siRNA对照对施万细胞进行转染,采用RT-PCR检测转染效率,Transwell小室检测施万细胞的迁移能力。结果与结论:①电刺激组神经残端miR-741-3p荧光强度低于对照组;②数据库预测结果显示有69个基因可能是miR-741-3p靶基因,Radil是预测靶基因之一,主要参与细胞黏附和迁移;③与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组施万细胞迁移数增多(P<0.05);与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组施万细胞迁移数减少(P<0.05);与siRNA对照组相比,Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05);④与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组Radil的表达水平升高;与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组Radil的表达水平降低;⑤与miR-741-3p抑制物+siRNA对照组相比,miR-741-3p抑制物+Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05)。结果表明,电刺激通过下调miR-741-3p调控Radi的表达来促进施万细胞迁移。