细粒棘球绦虫EgG1Y162-1/2重组蛋白诱导小鼠免疫应答特点的比较

目的研究和对比经生物信息学分析后重组构建的EgG1Y162-1/2蛋白诱导小鼠产生免疫应答反应的特点。方法随机将60只小鼠分5组,根据所注射抗原的不同分为EgG1Y162-1组、EgG1Y162-2组、GST对照组、佐剂组和正常对照组。每2周免疫1次,共免疫4次。采集免疫前后的小鼠血清进行Elisa检测抗体效价;流式细胞术检测不同时间点淋巴细胞亚群(CD4^+T细胞和CD8^+T细胞)的动态变化;免疫10周后用细粒棘球蚴感染攻击小鼠,对比小鼠脾淋巴细胞体外刺激后的增殖反应、脾细胞凋亡率和小鼠囊重抑制率的检测结果。结果免疫后第10周,EgG1Y162-2组抗体滴度为1∶20 480高于EgG1Y162-1组抗体滴度1∶5 120。经原头蚴感染攻击的EgG1Y162-2组的淋巴细胞亚群(CD4^+T细胞、CD8^+T细胞)百分比均高于EgG1Y162-1组,且差异有统计学意义(P <0.05),但CD4^+T/CD8^+T细胞比值差异无统计学意义(P>0.05)。免疫后的EgG1Y162-2组小鼠脾淋巴细胞在体外被特异性刺激后增殖水平高于EgG1Y162-1组,差异有统计学意义(P <0.05)。检测显示EgG1Y162-2组的脾细胞凋亡率低于EgG1Y162-1,差异有统计学意义(P <0.05)。疫苗保护实验中发现EgG1Y162-1组的小鼠囊重抑制率比EgG1Y162-2组低,差异有统计学意义(P <0.05)。结论EgG1Y162-2抗原比EgG1Y162-1抗原具有更强的免疫优势作用,本研究不仅证明了生物信息学分析表位的准确性,也提示该表位信息丰富的抗原值得作为疫苗的保护性抗原进行深入研究。

卷曲螺旋结构域蛋白2通过促进线粒体自噬抑制帕金森病SH-SY5Y细胞凋亡

背景:卷曲螺旋结构域蛋白2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing 2,CHCHD2)能否调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在帕金森病中发挥神经保护作用尚未可知。目的:探讨CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中对PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬发挥的作用及机制。方法:利用重组质粒转染技术过表达或敲低CHCHD2,用6-羟基多巴胺构建SH-SY5Y细胞帕金森病模型后分对照组、模型组、过表达阴性对照+6-羟基多巴胺组、敲低阴性对照+6-羟基多巴胺组、过表达CHCHD2+6-羟基多巴胺组和敲低CHCHD2+6-羟基多巴胺组。Western blot及RT-qPCR检测CHCHD2的表达;Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、MFN1、COXⅣ、DRP1、PINK1、Parkin、TIM23、Bax、Bcl-2及cleavedcaspase3蛋白表达;CCK-8、JC-1和活性氧试剂盒检测细胞活性、线粒体膜电位和活性氧水平,单丹磺酰尸胺染色观察细胞自噬情况,透射电镜观察自噬溶酶体。结果与结论:①与对照组相比,模型组细胞活性、线粒体膜电位及CHCHD2、PINK1、Parkin蛋白表达降低,活性氧水平、凋亡水平及LC3Ⅰ/Ⅱ、p62蛋白表达升高(P<0.05),并观察到自噬溶酶体的存在;②与模型组相比,过表达CHCHD2能降低细胞活性氧水平,升高线粒体膜电位及PINK1、Parkin和MFN1蛋白表达水平,并观察到线粒体自噬溶酶体增多,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用,并伴有COXⅣ、TIM23和p-DRP1蛋白表达的升高(P<0.05);③与模型组相比,过表达CHCHD2能减少细胞凋亡,上调Bcl-2并下调Bax及cleavedcaspase3蛋白的表达,而敲低CHCHD2后有与上述相反的作用(P<0.05);④结果提示,CHCHD2在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中可以通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善线粒体功能从而减轻细胞凋亡发挥神经保护作用。

细粒棘球绦虫蛋白egG1y162-1、egG1y162-2的抗原表位比较

目的分析蛋白egG1y162-1、egG1y162-2的氨基酸序列,了解其理化性质及二级结构特点,预测比较其抗原表位,为包虫病的免疫学诊断及表位疫苗的研制提供理论依据。方法采用生物信息学技术,利用在线软件ProtParam分析egG1y162-1和egG1y162-2的理化性质,使用DNAstar软件的protean等程序分析egG1y162-1和egG1y162-2蛋白的二级结构特点,运用在线软件IEDB等对egG1y162-1和egG1y162-2蛋白各参数进行综合分析并预测其抗原表位。结果综合分析各参数预测egG1y162-1的优势B细胞表位为9～28位氨基酸残基(LTKELKTTLPEHFRWIHVGS),egG1y162-1上29～36位氨基酸残基(RSLELGWN)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位;egG1y162-2的优势B细胞表位为25～39位氨基酸残基(EGLKPSTFYEVVVQAFKGGS)、41～60位氨基酸残基(KGGSQVFKYTGFIRTLAPGE),egG1y162-2上26～41位氨基酸残基(GLKPSTFYEVVVQAFK)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位。结论通过对细粒棘球绦虫蛋白egG1y162-1、egG1y162-2进行抗原表位分析,发现二者均存在评分较高的优势T表位和B表位,且存在人鼠共同T表位,而egG1y162-2的各方面指标要优于egG1y162-1,这对包虫病的诊断和疫苗研究有重要意义。

细粒棘球蚴EgG1Y162-2与CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白结构预测及表位分析比较

目的采用生物信息学的方法,应用相关软件对EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的氨基酸序列进行分析,了解其理化性质及结构特点,预测并比较其抗原表位,为CTLA-4IgV-EgG1Y62-2蛋白作为包虫病表位疫苗的研究奠定基础。方法利用ProtParam在线软件分析EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的理化性质;运用DNAstar中的protean软件与在线SOPMA软件预测EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的二级结构;应用I-TASSER在线软件预测并比较EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的三级结构,并使用BepiPred1.0,IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测与分析。结果预测EgG1Y162-2蛋白由69个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占7.69%、30.77%、15.38%和46.15%。预测的3条T细胞优势表位分别是1-18、21-43和47-62位氨基酸,2条B细胞优势抗原表位分别是9-28与57-69位氨基酸;CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白由208个氨基酸组成,稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占13.46%、32.21%、7.69%和46.63%。预测的3条优势T细胞表位分别是143-154、165-177和183-199位氨基酸。2条B细胞优势抗原表位分别为151-167和197-205位氨基酸。结论EgG1Y162-2和CTLA-4IgVEgG1Y162-2蛋白均存在优势T抗原表位与B抗原表位,且T/B联合表位存在高度重合。说明CTLA-4IgV与EgG1Y162-2蛋白通过Linker序列连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白的优势表位产生影响。因此,将CTLA-4IgV基因与特异性抗原EgG1Y162-2基因进行融合表达可能会增强疫苗的免疫效果,这对囊型包虫病多价复合疫苗的研究具有重大意义。

融合蛋白接头linker在细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4)中的选择设计

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列。方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗。在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测。结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点。设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移。三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移。结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗。

细粒棘球绦虫多价EgA31-EgG1Y162抗原序列优化分析

目的:将优化的EgA31-EgG1Y162抗原基因构建于pET30a上,诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达效果,用生物信息学软件分析优化的EgA31-EgG1Y162抗原序列,为构建高效的疫苗奠定理论基础。方法:运用ProtParam,DNAstar,E.coli Codon Usage Analyzer等多种生物信息学软件分析优化后EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性质,比较其优化前后序列的异同点及抗原表位分布情况等。结果:EgA31-EgG1Y162蛋白属于不稳定性蛋白且亲水性蛋白,通过网上在线软件分析,优化序列的密码子中不含利用率低的密码子。表位预测分析确定6个T细胞表位的氨基酸区域1~15、86~97、177~193、359~388、305~319、344~358和7个B细胞表位为102~112、172~204、318~334、343~353、394~409、415~431、443~458。结论:多价EgA31-EgG1y162融合抗原蛋白的优化序列中不含利用率低的密码子,且T和B细胞表位未受影响,为重组蛋白体外的有效表达奠定实验基础,对包虫病的多价表位疫苗研究具有重要的指导作用。

HO-1对SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白和PLK2表达影响

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白与Polo样激酶2(PLK2)水平的影响。方法采用Western blot方法,检测转染携带HO-1基因片段质粒48h后的SH-SY5Y细胞α-突触核蛋白的表达。给予不同浓度的HO-1激动剂钴原卟啉(CoPPIX)48h后,检测SH-SY5Y细胞PLK2的表达。结果高表达HO-1可降低细胞内α-突触核蛋白水平(t=2.672,P<0.05),10和25μmol/L的CoPPIX通过激活HO-1使PLK2表达上调(F=30.75,q=7.64、10.78,P<0.01)。结论 HO-1可使SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白表达下调,此过程可能与调控PLK2水平有关。

胰腺癌组织中星形胶质细胞上调基因-1、性别决定区Y框蛋白2的表达及与患者临床特征和微血管密度的关系

目的探讨胰腺癌组织中星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)的表达及与患者临床特征和微血管密度(MVD)的关系。方法收集原发性胰腺癌患者的胰腺癌组织80例和癌旁组织80例,采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2的表达情况及MVD,分析胰腺癌组织中AEG-1、SOX2表达情况与胰腺癌患者临床特征和MVD的关系。结果胰腺癌组织和癌旁组织中AEG-1、SOX2表达情况比较,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。低分化、有淋巴结转移胰腺癌患者胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达率分别高于中高分化、无淋巴结转移的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。Logistic回归分析结果显示,低分化、有淋巴结转移均是SOX2高表达的独立危险因素(P﹤0.05)。AEG-1、SOX2高表达胰腺癌组织中MVD均明显高于AEG-1、SOX2低表达的胰腺癌组织(P﹤0.01)。Spearman相关分析结果显示,AEG-1、SOX2表达均与MVD呈正相关。结论胰腺癌组织中AEG-1、SOX2高表达,且与胰腺癌分化程度、淋巴结转移情况有关,AEG-1、SOX2表达与MVD均呈正相关。

SOX7靶向ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠癌血管生成

目的探讨性别决定区Y框蛋白7(SOX7)对结直肠癌血管生成的影响及潜在作用机制。方法应用免疫荧光检测结直肠癌患者组织样本中SOX7表达水平,之后通过裸鼠、转染SOX7 mimic的人结直肠癌细胞系SW480细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养进一步研究。用Western-blot验证SOX7与ERK1/2/PD-L1对结直肠癌细胞的相关蛋白表达的影响。用CCK8检测SOX7与ERK1/2/PD-L1对HUVEC增殖的影响。通过体外内皮细胞成管实验测定SOX7与ERK1/2/PD-L1对肿瘤血管生成的影响。结果SOX7在人结直肠癌组织中表达被抑制(P<0.01),同时SOX7的过表达抑制了小鼠体内肿瘤生长(P<0.01)。SW480细胞中SOX7的过表达抑制了ERK1/2、c-Jun的表达,并在ERK1/2的激动剂Senkyunolide I的作用下上调了SW480细胞的ERK1/2、c-Jun蛋白表达(P<0.01),逆转了SOX7对SW480细胞中ERK1/2、c-Jun蛋白表达的影响(P<0.01)。HUVEC中SOX7抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,Senkyunolide I上调了HUVEC的PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,并逆转了SOX7对HUVEC中上述相关蛋白表达的影响(P<0.01)。PD-1/PD-L1 Inhibitor 3抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,SOX7过表达在PD-1/PD-L1 Inhibitor 3的影响下并没有表现出抑制作用。CCK8实验结果显示SOX7过表达显著抑制了HUVEC的增殖能力,Senkyunolide I作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显上升,PD-1/PD-L1 Inhibitor 3作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显下降,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。成管实验结果显示SOX7过表达抑制了HUVEC的血管生成,Senkyunolide I强烈加速了血管生成,而PD-1/PD-L1 Inhibitor 3血管生成则被显著抑制,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。结论SOX7通过ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠肿瘤的增殖和血管生成,SOX7可能是晚期CRC患者临床治疗中潜在的抗血管生成靶点。

盐胁迫下小偃麦酵母双杂交文库构建及TtLEA2-1互作蛋白筛选

【目的】构建小偃麦酵母双杂交(Y2H)文库,筛选胚胎发育晚期丰富蛋白(TtLEA2-1)的互作蛋白,为探究该基因的功能和表达调控机理提供理论参考。【方法】以小偃麦Y1805为材料,经提取RNA、分离mRNA、cDNA合成和均一化(DSN)处理后进行BP(attB和attP位点)重组反应,把重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建cDNA初级文库。抽提初级文库质粒,以pGADT7-DEST载体进行LR(attL或attR位点)重组反应,再转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,构建Y2H文库。【结果】对初级文库和Y2H文库进行质量分析,其滴度分别是3.98×10^(6) CFU/mL和6.14×10^(6) CFU/mL,库容量分别为7.96×10^(6) CFU和1.23×10^(7) CFU,重组率均为100%。从Y2H文库中挑取的24个单克隆的插入片段长度为850~4000 bp,平均片段长度大于1000 bp。采用Y2H技术和回转验证试验,从小偃麦Y2H文库中筛选了48个可能与TtLEA2-1互作的蛋白。48个TtLEA2-1互作蛋白中,有7个互作蛋白富集在遗传信息处理通路,4个蛋白富集在蛋白质家族:遗传信息过程通路,4个蛋白富集在核苷酸代谢通路,3个蛋白富集在甘氨酸生物合成和代谢通路,2个蛋白富集在碳水化合物代谢通路;富集在蛋白质家族:代谢、细胞过程、环境信息处理、氨基酸代谢通路的蛋白各有1个。【结论】构建的Y2H文库质量高、完整性好和覆盖面广,成功用于小偃麦盐胁迫响应基因互作蛋白的筛选试验,也为新基因发掘及其表达调控机理研究提供高效、便捷途径。

重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162的原核表达、纯化及鉴定

目的利用pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162重组质粒,诱导表达、纯化获得EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162目的蛋白,并对其进行鉴定,为后续研究提供前提条件。方法利用双酶切的方法验证pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162质粒,并将其转化至E.coli BL21(DE3)菌株,获得表达菌株。采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白,菌液超声破碎后,经SDS-PAGE检测上清及沉淀中蛋白的表达。通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。结果成功鉴定重组质粒pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162;重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162在IPTG终浓度为0.5 mmol/L,28℃条件下诱导6 h,上清中的蛋白表达量最高;300 mmol/L咪唑时洗脱得到的目的蛋白较多,洗脱效果较好;Western blot检测重组蛋白EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162能被相应抗体识别,反应条带在35 ku处,与预期相符。结论成功构建pET30a-EgG1Y162-GGGGSGGG-EgG1Y162重组质粒,表达出相应重组蛋白,为细粒棘球病重组疫苗的研究创造条件。

LINC00612靶向结合Bcl-2抑制Aβ1-42孵育的神经元凋亡

目的探讨LINC00612对β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法利用Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞建立阿尔茨海默病神经元损伤模型。应用qRT-PCR实验检测Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中LINC00612的表达。将LINC00612过表达质粒转染至Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞,Western blot实验检测Bcl-2的表达,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡。RNA-pulldown和RIP实验检测LINC00612与Bcl-2的结合作用。结果LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中低表达。过表达LINC00612显著增加Bcl-2表达量,降低细胞凋亡。RNA-pulldown和RIP实验结果显示LINC00612能够与直接Bcl-2结合。结论过表达LINC00612能够上调Bcl-2表达量,抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡。

细粒棘球蚴EgG1Y162-2基因的克隆、蛋白表达及纯化鉴定

目的构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白,为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法以细粒棘球蚴cDNA为模板,利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因,经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达大量蛋白,采用亲和层析方法纯化重组蛋白;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白纯化水平,蛋白免疫印迹(Western blot)法鉴定表达产物。结果成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒,诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15×10^(3)处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带,且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示,纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。结论成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒,诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白,为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

细粒棘球蚴重组蛋白EgG1Y162-2诱导表达条件的优化及其蛋白结构预测

目的优化探索重组质粒pET30a-EgG1Y162-2蛋白表达条件并预测其蛋白结构模型。方法将构建的重组质粒pET30a-EgG1Y162-2转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用不同浓度的IPTG进行不同时间段的蛋白诱导表达,诱导后的菌液超声破碎、离心,分别取上清和沉淀用SDS-PAGE分析重组蛋白EgG1Y162-2的表达情况,Western blot鉴定表达蛋白的反应原性。采用在线SWISS MODEL预测EgG1Y162-2蛋白的三维结构。结果EgG1Y162-2蛋白在37℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导4 h条件下的表达量较高,蛋白相对分子质量约为15×10~3,与预期相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别。在线Swiss-model预测EgG1Y162-2-2蛋白3D结构模型,与4Ixo.1.A结构的相似度为37.71%。结论优化的重组蛋白EgG1Y162-2表达最优条件预测的该蛋白三维结构,为细粒棘球蚴疫苗EgG1Y162-2抗原的功能研究奠定了基础。

细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2诱导表达条件探索

目的探索细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的最佳诱导表达条件,并对其蛋白结构进行预测。方法构建p ET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组质粒,将其转化至Ecoli.BL21(DE3)细菌中,选择不同的时间段和温度,用不同浓度的IPTG进行诱导蛋白表达。将得到的菌液通过超声破碎,经离心后用SDS-PAGE分别分析上清和沉淀中重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的表达情况。Western Blot鉴定重组蛋白表达。鉴定成功后进行大量诱导表达。采用生物信息学的方法,使用在线软件SWISS MODEL对HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白三维结构进行预测。结果HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白在28℃条件下,诱导4 h,IPTG的浓度为0.2 mmol/L时可溶性蛋白表达量达到最大。蛋白的相对分子量约为29 kD,结果与预期相符。其蛋白三维结构的预测与2×44.1.A结构的相似程度为78.13%。结论探索出HIS-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白最佳诱导表达条件,并成功预测出其蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的进一步研究创造条件。

MTSS1与SOX2在结肠癌中的表达及其对术后患者预后的影响

目的探讨肿瘤转移抑制蛋白-1(MTSS1)与性别决定区Y Box2蛋白(SOX2)在结肠癌中的表达及其对术后患者预后的影响。方法选取2015年1月—2016年1月秦皇岛市第一医院普外科收治的60例行结肠癌根治术治疗患者作为研究对象;采用免疫组化法检测肿瘤组织及癌旁组织中MTSS1与SOX2表达情况,比较其阳性表达率,分析MTSS1及SOX2阳性表达对患者预后质量的影响。结果结肠癌组织中MTSS1及SOX2表达阳性率均低于癌旁组织,且差异有统计学意义(χ~2=9. 799、21.645,P <0. 01);不同肿瘤分化程度、血管侵犯、淋巴结转移患者肿瘤组织中MTSSI及SOX2阳性表达率比较差异有统计学意义(MTSS1:χ~2=15.276、20.447、11.198,P<0.0];SOX2:χ~2=17.284、16.168、48.534,P <0.01);肿瘤分化程度、血管侵犯与淋巴结转移与MTSS1、SOX2阳性表达显著相关(β=1.745、1.792、1.288、1.981、1.784、1.899,P均<0.05); MTSS1及SOX2阳性表达患者生存率明显高于阴性表达患者,且差异有统计学意义(χ~2=6.623,P<0.05)。结论MTSS1及SOX2在结肠癌中阳性表达与患者预后质量密切相关,可用于评估患者预后质量。

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162-2(4)的制备及鉴定

目的对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行原核表达并初步鉴定。方法利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过Eco R I和SalⅠ双酶切构建p ET30a-EgG1Y162-2(4)重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。结果构建的重组疫苗EgG1Y162-2(4)三维结构串联的4个Eg G1Y162-2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)在0.2 mmol/L IPTG37℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)在约39 k Da位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4),为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。

新型方酰胺化合物bpV(pis)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤保护作用研究

目的:探讨新型方酰胺化合物双过氧(吡啶-2-方酰胺)氧代钒酸钾[bpV(pis)]对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpyridinium iodide,MPP^(+)iodide)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用及可能机制。方法:将SH-SY5Y细胞分别给予20、200、2000 nmol/L低中高3个浓度的bpV(pis)预处理12 h,然后与神经毒性药物MPP^(+)(1 mmol/L)共处理24 h复制帕金森病(Parkinson′s disease,PD)细胞损伤模型,最后用CCK-8法检测各组细胞存活率,Western blotting检测各组细胞p-PKB(Ser^(473))表达水平变化。选择最适bpV(pis)浓度进一步进行作用机制研究,并用1μmol/L的LY294002阻断PI3K/PKB信号通路,然后用CCK-8法检测各组细胞存活率变化,Western blotting检测各组细胞p-PKB(Ser^(473))、Bcl-2及Bax水平变化。结果:与模型组相比,中、高浓度bpV(pis)组细胞存活率显著提高(P<0.05),p-PKB(Ser^(473))水平升高(P<0.05)。使用LY294002将PI3K/PKB阻断后,bpV(pis)对细胞存活率的提高和对Bax/Bcl-2表达比值的升高作用均被抑制(P<0.05)。结论:bpV(pis)可通过激活PKB活性来提高MPP^(+)诱导损伤的SH-SY5Y细胞的存活率,并减少细胞凋亡。

玉屏风多糖对草鱼肠黏膜形态结构及主要免疫与吸收相关基因表达的影响

本试验旨在探讨不同比例玉屏风多糖对草鱼肠黏膜形态结构及主要免疫与吸收相关基因表达的影响。试验选择750尾平均体重为(74.50±2.50)g的健康草鱼,随机分为5组,每组6个重复,每个重复25尾。对照组(Ⅰ组)投喂基础饲料,试验组(Ⅱ~Ⅴ组)投喂在基础饲料基础上分别添加0.8、1.2、1.6、2.0 g/kg玉屏风多糖的试验饲料。预试期7 d,正试期28 d。结果表明:1)与对照组相比,在试验第14天时,Ⅴ组的隐窝深度显著降低(P<0.05),而绒腺比则显著提高(P<0.05)。2)对照组相比,在试验第7天时,Ⅲ和Ⅳ组头肾中白介素-2(IL-2)mRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组头肾中干扰素γ(IFN-γ)mRNA相对表达量均极显著提高(P<0.01),Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组肠道中钠葡萄糖转运蛋白1(SG LT-1)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)mRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01))。3)与对照组相比,在试验第14天时,Ⅳ和Ⅴ组头肾中IL-2 mRNA相对表达量极显著提高(P<0.01),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组头肾中IFN-γmRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组肠道中SG LT-1和G LUT-2 mRNA相对表达量极显著提高(P<0.01)。4)与对照组相比,在试验第21天时,Ⅳ组头肾中IL-2 mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组头肾中IFN-γmRNA相对表达量极显著提高(P<0.01),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组肠道中SG LT-1和G LUT-2 mRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01)。5)与对照组相比,在试验第28天时,Ⅳ和Ⅴ组头肾中IL-2 mRNA相对表达量极显著提高(P<0.01),Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组头肾中IFN-γmRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组肠道中SGLT-1 mRNA相对表达量显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01)。综上所述,在草鱼饲料中添加一定量的玉屏风多糖能够改善肠黏膜形态结构,促进肠道中SGLT-1和GLUT-2基因的表达,调控头肾中IL-2和IFN-γ基因的表达,从而提高肠道吸收功能、增强机体免疫力。从节约饲养成本出发,草鱼饲料中玉屏风多糖最适添加量为1.6 g/kg。