细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性研究

目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值.方法:ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2wk皮下免疫1次,在第3次免疫后2wk,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20wk剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果:与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为96.6%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG,IgG1,IgG2a和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05).结论:细粒棘球绦虫诊断抗原P-29重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子.

细粒棘球蚴重组EgP-29诱导免疫小鼠脾细胞增殖及细胞因子水平的变化

目的探讨细粒棘球蚴重组抗原(rEgP-29)接种小鼠后的免疫保护机制。方法ICR小鼠随机分为免疫组和对照组,采用rEgP-29免疫、Eg原头蚴攻击感染小鼠后20周,以MTT法检测经刀豆蛋白(ConA)和rEgP-29刺激后T淋巴细胞增殖水平,ELISA法检测体外脾细胞诱生的IL-2、IL-4和IFN-γ水平。结果MTT法检测证实rEgP-29免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05);ELISA法检测表明,免疫组小鼠经ConA或rEgP-29诱生的IL-2、IFN-γ水平与对照组相比显著增加(P<0.05),而IL-4水平无明显变化。结论rEgP-29可能诱导Th1型免疫应答为主,对抗Eg原头蚴攻击感染。

细粒棘球绦虫重组P29蛋白对原头蚴感染小鼠肝脏组织中TLR4及NF-кB表达的影响

目的观察细粒棘球绦虫重组P29蛋白(rP29)对原头蚴感染的小鼠肝脏组织Toll样受体(TLR4)与核因子-κB(NF-κB)表达变化的影响。方法36只BALB/c的雌性小鼠,每组12只,随机分为PBS组、佐剂组和重组P29蛋白免疫组(rP29组)。PBS组和佐剂组分别注射相应的PBS和佐剂;rP29组小鼠于皮下多点注射细粒棘球绦虫重组P29蛋白(10μg/只),分别于第2、4周加强免疫;于末次免疫后2周,3组BALB/c小鼠均腹腔接种细粒棘球蚴原头蚴(1500个/只);感染后24周,摘眼球取血,处死小鼠取肝脏,切片苏木素-伊红染色(HE)观察小鼠肝脏组织的形态,Real Time PCR和Western blot法检测小鼠组织中TLR4、NF-κB-p65基因的相对表达量和蛋白表达水平。结果重组P29蛋白组肝细胞边界清楚、排列整齐,偶见炎性细胞浸润,而对照组出现较多炎性细胞浸润。重组P29蛋白组小鼠肝脏组织中的TLR4 mRNA的相对表达量为1.74±0.52,对照PBS组和佐剂组分别为1.0±0.02和1.12±0.16;重组P29蛋白组小鼠肝脏组织中的NF-κB-p65 mRNA的相对表达量为3.45±0.17,对照PBS组和佐剂组分别为1.0±0.01和2.65±0.48。重组P29蛋白免疫组TLR4和NF-κB-p65 mRNA相对表达量均高于PBS组和佐剂组。同时,重组P29蛋白组小鼠肝脏TLR4和NF-κB-p65蛋白表达量与PBS组和佐剂组相比均增高。结论重组P29蛋白能够增加细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织中TLR4、NF-κB-p65 mRNA和蛋白的表达。

重组质粒pEGFP-N3-APC在结肠癌细胞株HT-29中的表达

【目的】构建含有APC蛋白功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒,转染结肠癌细胞HT-29,观察重组质粒的表达。【方法】设计引物分别扩增5条APC基因功能区域片段。将扩增片段与pEGFP-N3载体连接后挑取阳性克隆,行菌落PCR和测序鉴定。使用Lipofectamine 2000将重组质粒转染结肠癌细胞株HT-29,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。【结果】构建5条带有APC不同结构域重组真核表达载体pEGFP-N3-APC,重组真核表达载体转染HT-29细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达。【结论】真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。

重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性。方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达。用金属螯合层析法纯化重组蛋白。薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量。间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价。Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性。结果1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高(占细菌总蛋白量的36%),主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1∶4 960和1∶5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性。结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列。重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系。

miR-29和ZO-1在大鼠血神经屏障中的作用研究

目的:观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt PA)通过miR-29对大鼠外周神经闭锁小带蛋白-1(ZO-1表达水平的影响。方法:健康雌性SD大鼠随机分为对照组(Control)、rt PA组(rt PA)和无催化活性rt PAi组(rt PAi)。3组大鼠分别在坐骨神经旁注射生理盐水、rt PA和rt PAi,2 h后利用real time RT-PCR、Western Blot及免疫荧光方法检测坐骨神经内ZO-1的mRNA和蛋白表达水平变化,并采用real time RT-PCR方法检测坐骨神经miR-29的表达水平。结果:与对照组相比,rt PA组大鼠坐骨神经周围注射rt PA后,ZO-1的mRNA表达下降(P <0. 05),Western Blot发现ZO-1蛋白表达水平下降(P <0. 05),免疫荧光检测同样发现ZO-1表达减少;无催化活性的rt PAi处理大鼠坐骨神经后,神经束膜内ZO-1的mRNA及蛋白水平同样明显下降(P <0. 05);与对照组相比,rt PA和rt PAi处理2 h后大鼠坐骨神经内miR-29表达均明显增高(P <0. 05)。结论:rt PA通过减少神经束膜中ZO-1表达水平,增加神经束膜通透性,其作用不依赖于其对凝血酶原复合物的催化功能,可能通过增加miR-29表达下调ZO-1蛋白表达水平。

重组人白介素-29-Fc融合蛋白在HEK-293F细胞中的表达及体外抗肿瘤活性分析

目的在人胚肾293F(human embryonic kidney 293F,HEK-293F)细胞中表达重组人白介素-29-Fc(recombinant human interleukin-29-Fc,rhIL-29-Fc)融合蛋白,并分析其体外抗肿瘤活性。方法构建重组UCOE-IL-29-Fc表达质粒,瞬时转染HEK-293F细胞,经表达、纯化后获得rhIL-29-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定;将rhIL-29和rhIL-29-Fc蛋白分别经左耳皮下免疫雌性日本大耳白兔,每组2只,0.5 mg/只,右耳静脉采血,分离血清,ELISA法检测半衰期;CCK-8试验检测rhIL-29-Fc蛋白对人结肠癌HT-29、人结肠癌HCT-116、人Burkkit淋巴瘤Daudi、人非小细胞肺癌NCI-H1975、人小细胞肺癌NCI-H209、人食管癌EC109和人胰腺癌PANC-1细胞的体外抗增殖效果,并计算半数抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC_(50))。结果重组表达质粒UCOE-IL-29-Fc经双酶切及测序鉴定证明构建正确,瞬时转染HEK-293细胞6 d后,收获培养上清,经纯化获得的rhIL-29-Fc融合蛋白相对分子质量与预期相符,蛋白浓度为1.5 mg/mL,纯度为93%,可与小鼠抗人IL-29抗体特异性结合。rhIL-29-Fc蛋白半衰期为25 h,对7种肿瘤细胞显示出不同程度的增殖抑制效应,对不同细胞的IC50也不同。结论利用HEK-293F细胞成功表达rhIL-29-Fc融合蛋白,该融合蛋白半衰期比rhIL-29延长了20 h。根据7种肿瘤细胞显示出不同程度的体外增殖抑制效应和IC50测定结果,发现rhIL-29-Fc融合蛋白的抗肿瘤活性高于rhIL-29。该研究为IL-29蛋白治疗肿瘤的开发奠定了基础。

人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析

为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白rh IL-29mut35。SDS-PAGE分析显示rh IL-29mut35的相对分子质量约23×103,Western Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测rh IL-29mut35对肿瘤细胞增殖的影响,rh IL-29mut35在不同质量浓度时对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均有抑制作用,高剂量组(1 000 ng/m L)rh IL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8增值的抑制率分别为(34.20±1.50)%、(27.30±0.31)%、(30.20±0.68)%、(29.13±1.40)%,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rh IL-29的(P<0.01),这为进一步研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。

抗菌肽-裂解酶融合抗铜绿假单胞菌蛋白的可溶表达与活性评价

目的通过与促溶蛋白融合表达,分离、纯化获得抗菌融合蛋白,并初步评价其抗菌活性。方法将绵羊骨髓细胞抗菌肽SMAP29的N端与源自噬菌体JD010裂解酶LysPA26的C端融合设计新的抗菌蛋白(AL)。通过同源重组构建pCold-His-TF-AL表达质粒。通过Ni-亲和层析和阴离子交换层析分离纯化AL,采用平板计数法初步评价AL的抗铜绿假单胞菌活性。结果在E.coli BL21(DE3)中,质粒pCold-His-TF-AL能明显表达出抗菌蛋白AL,并且90%以上的AL为可溶形式分布于E.coli破菌液的上清液中。可分离纯化得到纯度超95%的AL。0.05 mg·mL^(-1) AL在30 min内可将铜绿假单胞菌PAO1菌量降低5.55个对数单位,具较高的抗菌活性。结论通过采用Trigger Factor标签融合表达和冷休克诱导方法可实现AL的高效可溶表达,纯化的AL对铜绿假单胞菌具有明显的抗菌活性。

马来丝虫肌球蛋白29表位基因真核表达质粒及原核表达蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察马来丝虫肌球蛋白29(Brugia malayi myosin 29,Bm M29)表位基因真核表达质粒pc DNA3.1(+)-Bm M29和原核表达的纯化重组蛋白r Bm M29免疫小鼠诱导的免疫应答效果。方法在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21诱导表达重组蛋白r Bm M29,纯化后作为重组蛋白疫苗;纯化真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm M29作为核酸疫苗。核酸疫苗免疫注射部位为小鼠后腿胫前肌,重组蛋白为皮下多点注射。60只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组12只,分别注射PBS(100μg)、pc DNA3.1(+)/Cp G(100μg/30μg)、pc DNA3.1(+)-Bm M29/Cp G(100μg/30μg)、r Bm M29/Cp G(50μg/30μg)、pc DNA3.1(+)-Bm M29/r Bm M29/Cp G(前2次注射pc DNA3.1(+)-Bm M29/Cp G 100μg/30μg,第3次注射r Bm M29/Cp G 50μg/30μg),共免疫3次,每次免疫间隔2周。初次免疫后第4、6、8周,眼球摘除法采血制备血清,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体效价。免疫第8周处死小鼠,制备脾细胞悬液培养48 h,ELISA检测培养上清中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平。结果 ELISA检测结果显示,A、B、C、D和E组小鼠初次免疫后第4周血清中抗体的吸光度(A490值)分别为0.038±0.050、0.053±0.009、0.360±0.035、0.456±0.025、0.370±0.025,第6周分别为0.045±0.003、0.045±0.005、0.510±0.018、0.548±0.010、0.552±0.018,第8周分别为0.041±0.004、0.044±0.009、0.606±0.047、0.674±0.042、0.770±0.041,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05),第8周时,E组Ig G抗体的A490值高于C组和D组(P<0.05)。初次免疫后第8周,A至E组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的水平分别为(47.72±8.94)、(50.43±2.81)、(304.78±8.42)、(242.28±5.99)、(426.52±6.76)pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05),E组高于C组和D组(P<0.05);小鼠脾细胞培养上清中IL-4的水平分别为(60.00±11.14)、(57.71±15.95)、(93.17±12.56)、(96.67±11.48)、(101.17±5.81)pg/ml,C、D、E组均高于A、B组(P<0.05)。结论 pc DNA3.1(+)-Bm M29核酸疫苗和r Bm M29重组蛋白均可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,核酸疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫效果更佳。

人IL-29第43位Lys的定点突变及抗肿瘤活性初步分析

为获得人白介素-29(h IL-29)变异体并考察其对肿瘤细胞增殖的影响,基于对h IL-29成熟肽生物信息学的分析结果,通过大引物PCR方法将其肽链第43位赖氨酸(Lys)编码基因进行定点突变。将得到的h IL-29变异体基因插入质粒p PIC9KM,构建重组真核表达质粒p PIC9KM-h IL-29^(mut43),导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,经G418筛选得到高产菌株p PIC9KM-h IL-29^(mut43)/GS115,用甲醇诱导表达重组蛋白rh IL-29^(mut43)。检测rh IL-29^(mut43)对肿瘤细胞增殖的影响,结果显示该重组蛋白对结肠癌细胞HCT8、肺腺癌细胞A549、胃癌细胞SGC7901和肝癌细胞BEL7402的增殖均有抑制作用,且高浓度(1 000 ng/ml)下对上述4种肿瘤细胞的增殖抑制作用更强,增殖抑制率分别为(18.45±0.83)%、(27.14±2.99)%、(29.94±1.95)%和(25.22±0.42)%。与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。且其抑制增殖效应强于野生型h IL-29和阳性对照药人干扰素(IFN)-a2b。

LncRNA 017418及细胞因子在细粒棘球蚴rP29免疫小鼠中的表达分析

目的初步探讨长链非编码RNA 017418(lncRNA 017418)和细胞因子在细粒棘球蚴重组蛋白P29(rP29)诱导小鼠产生免疫反应中的表达。方法重组融合表达菌株pET28a-P29/BL21与LB液体培养基混合孵育,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化rP29。36只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、佐剂组和免疫组,每组12只,免疫组将纯化的10μg rP29与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,腹部皮下3点注射,总剂量100μl/鼠,佐剂组注射等体积弗氏完全佐剂,对照组不作处理;首次免疫后2周,相同剂量加强免疫1次,加强免疫采用弗氏不完全佐剂。加强免疫后2周,无菌环境下制备脾细胞悬液,分离淋巴细胞;流式细胞术分选淋巴细胞亚群CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA 017418、Notch1、白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-10在淋巴细胞中的表达量;采用SPSS 17.0统计学软件和GraphPad Prism6.0软件对实验结果进行分析。结果经IPTG诱导表达、亲和层析法纯化,rP29蛋白相对分子质量(Mr)约为31000。qRT-PCR检测lncRNA 017418在脾淋巴细胞中的相对表达量,免疫组为2.25±0.10,高于对照组(0.81±0.05)和佐剂组(0.99±0.13)(P<0.01)。流式细胞术分析的CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞所占比例分别为:对照组22.0%、9.2%和59.8%,佐剂组22.8%、7.6%和60.7%,免疫组22.1%、9.7%和60.4%。LncRNA 017418在免疫组CD4^+T淋巴细胞中的相对表达量为1.49±0.03,高于对照组(0.97±0.02)和佐剂组(1.06±0.10)(P<0.01),LncRNA 017418在免疫组CD8^+T细胞中的相对表达量为1.87±0.12,与对照组(2.06±0.14)和佐剂组(2.00±0.09)相比,差异无统计学意义(P>0.05),LncRNA 017418在免疫组B淋巴细胞中的相对表达量为1.03±0.03,与对照组(0.97±0.07)和佐剂组(1.08±0.12)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1在免疫组CD4+T淋巴细胞中的相对表达量为1.92±0.04,高于对照组(1.10±0.10)和佐剂组(1.20±0.08)(P<0.01),IL-2的相对表达量为1.45±0.07,高于对照组(1.07±0.08)和佐剂组(1.09±0.11)(P<0.05);IFN-γ的相对表达量为1.51±0.11,高于对照组(0.92±0.05)和佐剂组(1.03±0.14)(P<0.01、0.05);IL-10的相对表达量为0.52±0.01,低于对照组(0.95±0.04)和佐剂组(1.05±0.10)(P<0.01);对照组和佐剂组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关系数分析lncRNA 017418与Notch1、IL-2、IFN-γ之间存在正相关关系(r=0.8244、0.5902、0.8415,均P<0.01),与IL-10之间存在负相关关系(r=-0.4432,P<0.05)。结论LncRNA 017418在细粒棘球蚴rP29诱导的小鼠中表达上调,Notch1、IL-2、IFN-γ在CD4+T淋巴细胞中表达上调,IL-10在CD4+T淋巴细胞中表达下调。