柔嫩艾美耳球虫MIC1与MIC2相互作用的鉴定

目的观察柔嫩艾美耳球虫基因微线蛋白1(EtMIC1)和微线蛋白2(EtMIC2)之间的相互作用,为研究微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据。方法采用PCR方法克隆柔嫩艾美耳球虫EtMIC1和EtMIC2基因,构建不同的重组表达载体。将构建的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-EtMIC1及捕获质粒pGADT7-EtMIC2转化至Y2HGold酵母感受态,涂布于对应的营养缺陷培养基进行毒性和自激活活性检测。表达GST-EtMIC1和His-EtMIC2两种融合蛋白,纯化后通过GST-Pull down验证二者在体外的相互作用。将构建的pcDNA3.1-His-EtMIC1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2重组质粒转染HEK-293T细胞,RIPA裂解后取上清进行免疫共沉淀试验,鉴定二者在体内的相互作用。将真核表达载体pEtMIC1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151共转染HEK-293T细胞,激光共聚焦显微镜观察转染后的细胞内发出的红色荧光。结果pGBKT7-EtMIC1和pGADT7-EtMIC2单转化对酵母细胞无明显毒性作用,且自身无自激活活性,而pGBKT7-EtMIC1/pGADT7-EtMIC2共转化后能够在显色板上长出蓝色菌落,说明二者在细胞内可相互作用;GST-Pull down试验表明二者可在体外发生相互作用;免疫共沉淀和双分子荧光互补试验证实EtMIC1和EtMIC2在细胞内相互作用。结论EtMIC1和EtMIC2在体内、外均能够产生相互作用,为进一步探索微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据。